Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27 Aprile 2007 Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene pesanti delle Ig umane I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32 Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento e class switch. Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione), switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo, per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari.

Come funziona il controllo “cis” della catena pesante delle Ig Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma umano e di topo Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte) servono da segnale per i fattori ed enzimi per : i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti sterili) che nella plasmacellula e della memoria interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che fungono da secondi messaggeri con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno

Importanza della regolazione delle Ig I - interazione col sistema immune nelle funzioni fisiologiche e patologiche Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione primaria in se (in questo caso le Ig) Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da questa prima funzione Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc. Altri sistemi correlati (snc, digerente …)

Chi dice al linfocita quale “switch” fare E se lo “switch” è casuale quale è il segnale selettivo per cui nei distinti distretti restano i linfociti che producono un certo tipo di Ig Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed effetti della trascrizione delle Ig

Cosa si può chiedere A monte e a valle della trascrizione delle Ig cosa c’è e quali metafunzioni svolge Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso nessuno dei due. Per ora cerchiamo dei possibili esecutori Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla organizzazione della regione regolatrice e quindi sul genoma direttamente sul locus delle Ig Forse è un quadro intermedio con responsabilità del settore “risposta umorale”

L’organizzazione genomica Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14 q32, anche le catene leggere hanno la loro importanza relativa Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle catene pesanti Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo dell’enhancer centrale del complesso regolatore. 2 americani ed 1 francese

Il sito delle Ig umane è poco diverso dal topo Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è presente la duplicazione dei 4 geni delle regioni costanti Ig3, Ig1, Ig, Ig1 vedi la figura della mappa del locus Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR

strutture regolatrici delle catene pesanti delle Ig umane Chromosome 14q32 enhancer 5’ 3 enhancers   3 1 2 4  1   a2 geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili * V D J * regione duplicata reg. variab.* telomero

Strutture regolative della trascrizione Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’ Somatic hypermutation (SHM) class switch recombination (CSR) 3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene V Sequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS) interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (CH) e nelle IgH l’enhancer intronico (iE) L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in linee cellulari con delezioni di iE in cui c’era trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la trascrizione

bibliografia Henderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, 163-200 Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit. 148-163, Lippincott-Raven, Philadelphia Stavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 127-168 Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, 165-196 Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, 73-80 Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,317-345

IgH3’EC-1 A IgH3’EC-2 Chromosome 14 CHR77 SF AL928742 (40 kb) HS3 2 B HS3 U2 U4 U5 R3 HS1,2 E R3r U5r U1 R1 U 3 U6 U7 8r U6r HS4 Ub1 U4-5 U7r Ub2 R4 U9 R5 Ub3 U10 U11 U12 R6 SA2.5 A2R A2F Alu U15 U16 LTR END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 U14 U13 Ub4 1 H* Ua1 R2 U3 U8 Ua2 Ua3 Ua4 END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 K10 retrovirus ELK2 IgH3’EC-1 14 Ua5 A Telomere   3 1 2 4    CHR77 (35.616 kb) X76785 Y14407 AL928767 AL928765 U64453 Poly A site

A Selective amplification of HS1,2-B downstream Ca2 (IgH3’EC-2) Internal spacers Conserved sequence Unit Selective amplification of HS1,2-B downstream Ca2 (IgH3’EC-2) H 2m HS 3 B HS 1,2 E SA2.5 A2R A2F HS1,2 4420 bp ALLELE 3B P3Frw D3Rev EcoRI ALLELE 4B Poly A site 1m H* 5402 bp Selective amplification of HS1,2-A downstream Ca1 (IgH3’EC-1) ALLELE 1A ALLELE 2A ALLELE 3A ALLELE 4A A Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp Repeated element - 38 bp External element -17 bp Ua1 R1 R2 U1 U5 U4 U2 U3 R3 r R3 U6 U7 U8 Ub1 UU 3 4 r U4-5 U7r R3r U6r U5r Ub2 R4 14bp 16bp 20bp

A B     M1 M2 CM11 CM 4 CM 5 G A B G A B G A B 400 bp ALLELE 4 38bp Rp B 17bp El. 17bp El. END HS1,2 ALLELE 1A CORE enhancer 14bp Sp. ALLELE 2A 16bp Sp. ALLELE 3A  31bp El 20bp Sp. ALLELE 3B  ALLELE 4A  ALLELE 4B  Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-) Sites for : AP4; E47; MYOD; mE5 Sites for : NF-kB (Q6) Sites for : CMYB Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)

LCR (nel topo 4 enhancers) IgH3’EC-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus) V D J human chromosome 14 q 32 HS3 HS1,2 HS4   3 1 2 4  1   a2 telomere copia 1 copia 2 mouse Ig heavy locus HS3A HS1,2 HS3B HS4 L C R   a b 

cluster della catena pesante delle Ig IgH3’EC-2 Telomere   3 1 2 4  1   2 SF AL928742 (40 kb) CHR77 (35.616 kb) X76785 Y14407 AL928767 AL928765 U64453 IgH3’EC-1 Chromosome 14

Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR) PLASMACELLULE Cellule B proliferanti Cellula B attivata (centroblasto) IL-2; IL-4; IL-5; IgG2a o IgG3 IgA o IgG2b IgE o IgG1 IgM IFN-g IL-4 TNF-b Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-g; TNF-b; Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)

Locus catena leggera l Locus catena leggera k Locus catena pesante Cromosoma 22 Cromosoma 2 Cromosoma 14 LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig

riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE Locus Catene leggere V-J processing VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana Locus Catene pesanti D-J processing V-DJ processing VDJ riarrangiato VDJ riarrangiato CELLULE B Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

CELLULE B Locus Catene pesanti Locus Catene leggere ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE VJ riarrangiato VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche Plasmacellule Cellule Memoria Cellule B attivate Centrociti VDJ riarrangiato. Le catene m prodotte in forma di membrana Switch isotipico a Cg, Ca o Ce. Ipermutazione somatica Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. VDJ riarrangiato Catene m prodotte in forma secreta. Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo. VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J V(D)J Risultato dello switch Cricolo exciso Ricombinazione class switching (CSR) m d g3 g1 e a 2b 2a IgM IgE Switch region: Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb Il filamento non stampo è ricco in G Sm, Sa ed Se hanno un repeat di 5 bp. Sg ha un repeat di 49 bp. Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

Riparazione dei breaks C D F E Trascrizione regione S RNA editing ? AID? CSR ricombinasi? Riconoscimento delle regioni S accessibili Formazione di breaks al DNA Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili Formazione di strutture secondarie (R loop?) Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA Riparazione dei breaks S c-myc una regione S due regioni S Switch su un altro cromosoma traslocazione Class switching recombination Delezioni intra-switch 1 2 Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).

La risposta immunitaria cellulo mediata (linfociti T) umorale (non dell’umore) I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria (immunita’ acquisita) specifica. L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig). Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1 Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico.

A che serve lo studio della struttura? (aforismi) La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la fisiologia. La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del sistema. Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con la maturazione dei linfociti Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali

cluster della catena pesante delle immunoglobuline Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 sub-telomerico) Mappa della catena pesante delle IG Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad una sequenza costante. Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica, IgD funzione ancora non del tutto chiara. V D J m d g3 g1 ye a1 yg g2 g4 e a2 cluster della catena pesante delle immunoglobuline

Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC nell’uomo e nel topo  d g3 g1 g2b g2a e a 3’ 5’ TOPO LCR a UOMO  d g3 g1 ye a1 yg g2 g4 e a2 5’ 3’ LCR-A LCR-B SacII Eag I NaeI 120 Kb 130 Kb 180 Kb VH j    2 3 1 2 4  1 yg MluI 350 kb 50 kb LCR-A LCR-B

Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento Confronti in silicio : omologie di struttura ricerca cloni EST Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione) Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primati Conservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti) I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.) Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig Studio della diversa funzionalita’ Studio di espressione dei markers della maturazione Studio della induzione della maturazione e switch in vitro

Finalita’ Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico Le attivita’ coinvolte in questo modello sono: a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia) b) la proliferazione cellulare (linfomi) c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e malattie autoimmuni) Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”. Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????