BIOSENSORE : definizione TRASDUTTORE ELEMENTO BIOLOGICO ANALITA TARGET SEGNALE MISURABILE Membrana selettiva

Requisiti di un biosensore 1. Relevance of output signal to measurement environment 2. Selectivity and repeatability 3. Sensitivity and resolution 4. Dynamic range 5. Speed of response 6. Insensitive to temperature (or temperature compensation) 7. Insensitive to electrical and other environmental interference 8. Amenable to testing and calibration 9. Reliability and Self-Checking Capability 10. Physical robustness 11. Service requirements and price 12. Life time and Reusability

According to a recently proposed (1999) IUPAC definition: “A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element. A biosensor should be clearly distinguished from a bioanalytical system, which requires additional processing steps, such as reagent addition. Furthermore, a biosensor should be distinguished from a bioprobe which is either disposable after one measurement, i.e. single use, or unable to continuously monitor the analyte concentration”.

Elemento biologico di riconoscimento molecolare Enzimi (biosensore catalitico) -transformazione dell’analita in un prodotto misurabile -inibizione dell’ enzima da parte dell’ analita -modifiche dell’enzima indotte dall’analita Antigene-anticorpo -legame ad alta affinità con un tracciante che produce il segnale o direttamente reazione Ab-Ag senza tracciante DNA: -reazioni di ibridazione ad alta affinità Sensori Biomimetici - molecole ad alta affinità (singole catene di anticorpi,..) - polimeri imprintati Biosensori cellulari -inibizione della vitalità cellulare(respirazione,.. -proteine di transporto di membrana -neurorecettori (producono il signale attraverso i canali ionici -cellule (batteri, lieviti,..) geneticamente modificati per esprimere l’elemento di riconoscimento molecolare (recettore, proteina di legame,..)e un gene reporter per la trasduzione in un segnale misurabile (luc, lux, GFP,..)

BIOSENSORE : Trasduzione Il segnale che viene prodotto dalla interazione dell’ analita con l’ elemento biologico può essere: Potenziometrico modifiche nella distribuzione delle cariche che produce un potenziale elettrico Amperometrico movimento di elettroni in una reazione redox Calorimetrico produzione o assorbimento di calore dal processo chimico Ottico assorbimento, emissione, rifrazione, “scattering” ..della luce nella reazione Piezoelettrico variazioni di massa dovuti al legame dell’analita Foto-acustico,..……

Principio dei biosensori RECOGNITION LAYER TRANSDUCER Analyte Electro-active substance pH Changes Heat Light Mass changes Electrode pH electrode Semiconductor Thermistor Photon counter Piezoelectric Dv Enzyme Antibody Micro- Organism Cell Electric signal

Per Riassumere:

Cenni storici del Biosensori Concetto e principio -- Leland Clark (1956) Sensore per l’ urea -- Guibault & Montalvo (1969) Glucosio - Yellow Springs Instr. Co. (1973) Termistore enzimatico – Mosbach (1974) Electrodo a microorganismi – Divis (1975) Sensore per l’ Ossigeno a fibra-ottica – Lubbers & Opitz (1975) Immnosensore – Liedberg et al. (1982) Elettrodo enzimatico – MediSense Inc. (1987) BIAcore – Pharmacia, Sweden (1990) Nanosensore – Vo-Dinh (2000) This is an optically-based  biosensor (specifically a technique called surface plasmon resonance) which is sold  into the bioscience R & D laboratory market for the real time analysis of biological  interactions.  

Potenziali campi di applicazione farmaci, residui,tossine,.. negli alimenti microinquinanti nell’acqua e nell’aria monitorare un processo biologico virus, bacteria,.. ions composti organici analiti di interesse chimico-clinico e diagnostico …………… Sistemi complementari ai sistemi analitici tradizionali con l’obiettivo principale di ottenere una risposta rapida o in tempo reale

Biosensori Elettrochimici Potenziometrici : Viene misurato il potenziale di una cella a valore di corrente zero. Amperometrici : Si misura l’Intensità di corrente dovuto ad un processo Ox-red.

Biosensori potenziometrici Elettrodo di riferimento Risultato: Differenza di potenziale Processore di segnale I corrente = 0 Elettrodo indicatore

(elettrodo indicatore) Elettrodi ionoselettivi ISE ISE (elettrodo indicatore) Elettrodo di riferimento (esterno) Membrana [ai]campione V Ecell = Eind – Eref + Elj semplificata: Ecell = K + Eind Equazione di Nernst Ecell = K + 2.3 RT log [ai]campione zF Curva Standard Ecell Dove: E = Potenziale elettrochimico K = costante R = Costante dei gas (8.314 joules/(mole)(°K)) T = Temp. assoluta Z = Numero di elettroni trasferiti F = Costante di Faraday (96,487 coulombs/mole di elettroni) ai = Attività della specie ionica (ai = Cifi; dove C è la concentrazione dello ione ed f ilcoefficiente di attività . log [ai]campione

Esempi di elettrodi ionoselettivi Elettrodo a vetro Variazione di carica dovuta al legame di H+ alla membrana Risultato: variazione di potenziale ISFET Elettrodo per il Sodio

Elettrodo per il Potassio Esempi di elettrodi ionoselettivi Elettrodo per il Potassio Elettrodo per la CO2 Valinomicina

Elettrodi ISE Miniaturizzati La superficie dell’elettrodo è costituita da un film di Ag/AgCl serigrafato e da un film che permette un traferimento efficiente di energia tra la membrana di PVC , la superficie di AgCl e la membrana ionoselettiva. L’elettrodo di riferimento è costituito da un film di Ag/AgCl. Che deve essere in contatto con una soluzione a concentrazione nota di ioni Cl- per funzionare.

Esempio di biosensore potenziometrico (a) Membrana semi-permeabile (b) Biocatalizzatore (c) Membrana di vetro (d) Probe per il pH (e) Potenziale elettrico generato (f) Elettrodo interno Ag/AgCl (g) HCl diluto (h) elettrodo esterno di riferimento

Vantaggi e svantaggi dei Biosensori Potenziometrici Disponibilità di un elevato numero di enzimi utilizzabili. Elevata tecnologia disponibile e conoscenze scientifiche Facile installazione, misure semplici e dirette . Diverse configurazioni ( Statica, a flusso , micro ). Facile automazione e applicabilità Bassi costi. Svantaggi Scarsa selettività di alcuni biosensori. Il numero di biosensori disponibili è molto limitato

MOSFET variazione del potenziale applicato variazione di intensità di corrente Modulazione di I dal potenziale applicato

Transistor per misure di pH Elettrodo di riferimento Membrana Sensibile a H+ Membrana biocatalitica Membrana Iono selettiva silicio 500 m Il corpo principale è costituito da un chip di silicio con due aree +/- tipo-n. Il chip è isolato da un film di 0.1 m di SiO2 che forma la piattaforma del FET. Sopra vi è un film di materiale sensibile agli H+, la membrana ione selettiva, la membrana biocatalitica e quindi la soluzione contenente l’analita che è separata dalla parte sensibile del FET da un polimero inerte. Quando si applica un potenziale ai due elettrodi si avrà un passaggio di corrente attraverso il FET funzione del potenziale positivo rivelato al polo dello ione positivo. Questa corrente (I) viene confrontata con quella ottenuta con un ISFET non catalitico immerso nella stessa soluzione

Immagini di alcuni Biosensori ISFET

Differenza di potenziale Biosensori amperometrici Elettrodo di riferimento Risultato: Intensità di corrente Processore di segnale Differenza di potenziale prefissata Elettrodo di lavoro

introduzione elettrolita Membrana permeabile all’O2 Elettrodo ad Ossigeno Il biosensore amperometrico più semplice utilizza l’elettrodo ad ossigeno di Clark. Questo è costituito da un catodo di Pt al quale l’O2 si riduce ed un elettrodo di riferimento Ag/AgCl. . Ag anodo     4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e-   Pt catodo     O2 + 4H+ + 4e- 2H2O  Collegamento amplificatore introduzione elettrolita KCl 100 mM Filo di Ag ricoperto con AgCl Tubo di plexiglas Filo di Pt forgiato per essere sigillato da vetro ed avere una superficie piatta esposta all’analita Membrana permeabile all’O2

elettrodo pO2 L’elettrodo pO2 consiste di un catodo di platino e di un elettrode di riferimento Ag/AgCl.

Biosensori amperometrici di I generazione I biosensori amperometrici di prima generazione monitorano il consumo di O2 o la produzione di H2O2 associate all’ossidazione di un substrato da parte di un enzima ossidasi

Biosensore amperometrico per il glucosio La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi: Glucosio + FAD + H2O ———> Acido gluconico +FADH2 FADH2 + O2 ———> H2O2 + FAD La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore così l’elettrodo di lavoro compete con l’enzima per l’ossigeno molecolare. glucosio Membrana permeabile all’O2 .

Biosensore amperometrico per il glucosio Misure batch Misure in flusso Tipica risposta del biosensore amperometrico per il glucosio

Misure FIA (flow injectio analysis) Biosensore amperometrico per il glucosio Misure FIA (flow injectio analysis)

Biosensore ad acqua ossigenata La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per monitorare la produzione di acqua ossigenata. L’acqua ossigenata è ossidata all’elettrodo di lavoro secondo la seguente reazione: H2O2 —-——> O2 + 2H+ + 2e- L’enzima è immobilizzato e tenuto il più vicino possibile l’elettrodo di lavoro. E’ prodotta una corrente proporzionale alla concentrazione del metabolita da analizzare. Un fattore limitante di questi sensori è che sono dipendenti dalla solubilità dell’ossigeno nelle soluzioni campione.

Biosensori amperometrici di II generazione Si utilizzano dei “mediatori” che trasferiscono gli elettroni direttamente all’elettrodo bypassando la riduzione dell’ossigeno. I ferroceni rappresentano il gruppo di mediatori più utilizzati .

Biosensori amperometrici di III generazione

Biosensori Amperometrici Vantaggi Non influenzato dal drift dell’elettrodo di riferimento Risposta lineare. Sono più sensibili di quelli potenziometrici. E’ possibile miniaturizzarli Svantaggi La corrente amperometrica consuma l’analita e la sua diffusione influenza la risposta. La misura amperometrica viene eseguita ad un particolare potenziale di lavoro dove altre sostanze potrebbero reagire ed interferire. Il materiale all’anodo si consuma riducendone il tempo di utilizzo, paricolarmente quando si utilizzano film sottili di Ag/AgCl .

Sensori Piezoelectrici Sistemi piezoelettrici Cristallo di quarzo Elettrodo d’oro Microbilancia al quarzo QCM

Microbilancia al quarzo (QCM) Modifiche nell’intorno del cristallo

Biosensori Piezoelettrici Transduttore: microbilancia cristallo di quarzo (QCM) probe immobilizato DNA Target, Ag, Ligando Si forma un duplex, Ab-Ab, Complesso lig-recettore la massa aumenta Cala la frequenza di risonanza del cristallo

Biosensori Piezoelettrici La relazione tra massa m e frequenza f è data dalla nota relazione di Sauderbery: Dove: -Δf è la variazione di frequenza (Hz), -Δm è la variazione di massa della sostanza assorbita sulla superficie (g), - K è una costante che dipente dalla densità e dal tipo di cristallo (taglio), -A è la superficie (cm2) Cristallo di quarzo Oscillatore 10MHz Analita in soluzione

Biosensori Piezoelettrici elemento biospecifico Sensitive coating elemento biospecifico immobilizzato

immobilizzato sulla bilancia QCM Anticorpo anti-gD IgG immobilizzato sulla bilancia QCM

The amount of protein deposited on the films increases with time. The protein deposition appears to reach a plateau which represents maximum absorption onto the film.

Tecniche di immobilizzazione 1)Immobilizzazione fisica: operativamente semplice ma meno stabile. 2)Immobilizzazione chimica: operativamente complessa, ma più stabile Schema di reticolazione con BSA-gluteraldeide Schema di reticolazione su membrane carbossiliche con carbodimmide

Sviluppo di immunosensori Immobilizzazione di una proteina Sviluppo di immunosensori L’obiettivo è quello di minimizzare interazioni aspecifiche e quindi sviluppare un immunosensore specifico e con il vantaggio di non utilizzare un tracciante e quindi misurare direttamente l’interazione Ab—Ag Si può utilizzare per esempio: sistema avidin-biotin, thiol-dextran, DSP, silanizzazione e assorbimento.

Biosensore Ottico Risultato Riconoscimento molecolare Processore Ligando Immobilizzato Superficie del sensore Rivelatore Ottico Risultato Segnale Elettrico

Biosensore Ottico: Principi

Biosensore Ottico: Principi

Biosensore a fluorescenza Es: biosensori basati su esteri del boro

Biosensore a fluorescenza DETERMINAZIONE DI SUBSTRATI ENZIMATICI

Indirect Optical Immunosensors : FCFD Fluorescence Capillary Fill Device

Biosensore a fluorescenza Fiber-optic cholesterol sensor

Y Y Y Y Capture antibody Sample applied, antigen binds to capture antibody Y Other cells and debris washed away Y Laser on (( )) Detection antibody binds to antigen and fluoresces when laser turned on.

Evanescent Wave Technology Laser (635 nm) Evanescent wave 100 nm Waveguide Cy5 Excited Cy5 >650 nm signal recovered In pAmps Waveguide

Sistema ottico per misure intracellulari T. Vo-Dingh et al., Sensors and Actuators B, 2001

Sistemi ottici basati di misura della luce evanescente

Biosensori a risonanza di superficie plasmonica (SPR) SPR, fenomeno che avviene quando la luce è riflessa da un film sottile di un metallo

Prism Coupler-Based SPR Sensors I. Wavelength modulation II. Angular modulation

Biosensori a SPR: applicazioni

The Resonant Mirror Cuvette Vibro-stirrer in each well Sample Well Coupling Layer Resonant Mirror Prism Laser Low R.I. Layer Resonated hn Time Intensity of Resonated Light Detector Polariser f (arc sec)

Biosensore ottico ad onda evanescente n1 > n2

Substrati analizzabili con biosensori enzimatici

Biosensore calorimetrico ΔΤ= Q/Cs=-n ΔΗ/M Cs Q = –(n/M)/ΔΗ

Biosensore calorimetrico

Biosensori a DNA DNA a doppia elica Elettrodo di lavoro

Tipi di biosensori a DNA

Biosensori piezolelettrici a DNA Quartz crystal microbalance (QCM) transducers Immobilized DNA probe Target DNA Form duplex---mass increase Decrease in crystal’s resonance frequency

Immobilizzazione del DNA sulla QCM Immobilizzazione di DNA-biotina su di un elettrodo QCM modificato

Immobilizzazione del DNA sulla QCM Il DNA probe viene immobilizzato su di un cristallo piezoelettrico di quarzo ricoperto di streptavidina. La Streptavidina viene legata covalentemente ad uno strato monolayer costituito da 11-mercaptoundecanolo. Immobilizzazione del DNA sulla QCM Attivazione con EDC e NHS Probe: oligonucleotide biotinilato (Strept)avidina Biotina (Strept)avidina Strept)avidina Frequenza Hz Probe biotinilato Destrano 11-mercaptoundecanolo Tempo (sec) Oro

Biosensori Cellulari: potenziale d’azione Potenziale di azione dato dalla differenza di concentrazione di specie ioniche attraverso la membrana cellulare

Biosensori Cellulari: potenziale d’azione Misura del potenziale d’azione con un elettrodo

Biosensori Cellulari: potenziale d’azione Valutazione della sensibilità ad un agente tossico

Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici Misura della variazione di O2 con elettrodo di Clark Respirazione di cellule

Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici

Biosensori Cellulari Analyte Biosensor Signal Receptor LUCIFERASE Responsive Element LUCIFERASE

Biosensori bioluminescenti The Firefly Process: Oxyluciferin, AMP+Ppi, Light (560 nm) Luciferin, ATP, O2 Catalyst: Luciferase The Bacterial Process: Decanal FMNH2 O2 Decanoic acid, FMN*, H2O, Light, (490 nm) Catalyst: Luciferase

Biosensori bioluminescenti Light output is directly proportional to the metabolic activity of a cell Light Output Increasing Toxicity Bioluminescence decreases in direct proportion to the level of toxicity present

Biosensori bioluminescenti Normal levels of FMNH2 due to Active Respiration Bioluminescent cells Active Cell Reduced levels of FMNH2 due to Reduced Respiration Bioluminescence Reduced or stopped Damaged Cell following exposure to toxin

Multidisciplinarietà dei biosensori

Elemeno di bioriconoscimento Biosensori futuri Elemeno di bioriconoscimento

Ultime pubblicazioni sui biosensori

World Biosensor Market