PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer
PCR da DNA genomico
PCR da mRNA (RT-PCR)
Uso dei “linkers”
Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’
PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI
Proteine di fusione prom Tag o rep. cDNA term trascrizione traduzione
Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
Tamponi di elettroforesi
Soluzioni di caricamento
Soluzioni di caricamento Aumentano la densità del campione Colorano il campione Rendono visibile la corsa elettroforetica
Migrazione del DNA su gel
Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare HindIII
Fotodocumentazione
Recupero DNA da gel Elettroeluizione Agarosio “low melting” Solubilizzazione agarosio
Gel di acrilammide
Apparato per gel di acrilammide
Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)
Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide
Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 32P 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide
Gel di poliacrilammide di sequenza
Fasi di un progetto di sequenziamento clonaggio e preparazione del DNA reazioni di sequenza elettroforesi su gel di poliacrilammide interpretazione e raccolta dati
Vettori a singolo filamento
Fagemidi
Strategie di sequenziamento Primer specifici consecutivi Delezioni progressive Frammenti casuali (shotgun)
Reazioni base-specifiche
Confronto metodi di sequenziamento Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi
Sequenziamento automatico
Sequenziamento con Taq polimerasi