PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer.

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REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR)
Clonaggio (molecolare)
Clonaggio (molecolare)
Organizzazione delle unità di ripetizione dei geni per gli istoni in diverse specie.
Transcript della presentazione:

PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

PCR da DNA genomico

PCR da mRNA (RT-PCR)

Uso dei “linkers”

Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI

Proteine di fusione prom Tag o rep. cDNA term trascrizione traduzione

Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

Elettroforesi su gel di agarosio

Tamponi di elettroforesi

Soluzioni di caricamento

Soluzioni di caricamento Aumentano la densità del campione Colorano il campione Rendono visibile la corsa elettroforetica

Migrazione del DNA su gel

Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare  HindIII

Fotodocumentazione

Recupero DNA da gel Elettroeluizione Agarosio “low melting” Solubilizzazione agarosio

Gel di acrilammide

Apparato per gel di acrilammide

Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 32P 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

Gel di poliacrilammide di sequenza

Fasi di un progetto di sequenziamento clonaggio e preparazione del DNA reazioni di sequenza elettroforesi su gel di poliacrilammide interpretazione e raccolta dati

Vettori a singolo filamento

Fagemidi

Strategie di sequenziamento Primer specifici consecutivi Delezioni progressive Frammenti casuali (shotgun)

Reazioni base-specifiche

Confronto metodi di sequenziamento Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

Sequenziamento automatico

Sequenziamento con Taq polimerasi