Spettrometria di Massa

Cos’è uno spettrometro di massa Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Un’analisi mass spettrometrica può essere rappresentata dai seguenti passaggi: Introduzione del campione – Ionizzazione – Analisi della massa – Rivelazione degli ioni/analisi dei dati.

Scopi della spettrometria di massa Determinazione del peso molecolare Delucidazione della struttura molecolare Identificazione di componenti di una miscela Indagini quantitative Studi meccanicistici Studio di interazioni intermolecolari

Aree di interesse Proteomica Glicobiologia Genetica e medicina Biologia molecolare e cellulare Scienze ambientali Chimica dei polimeri Antiterrorismo Farmacologia Antidoping Archeologia Astronomia Analisi inorganica …e ancora tante altre

Caratteristiche della spettrometria di massa Intervallo di PM fino a centinaia di kDa Sensibilità dell’ordine delle picomoli o inferiore Acquisizione veloce dei dati Interfacce con metodi separativi Alta e bassa risoluzione

Spettrometria di massa   Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente 600.000.000.000.000.000.000.000 molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le molecole conviene usare il dalton (Da). 1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio (12C). In questa scala l'ossigeno (16O) pesa 15,9949 e l'idrogeno (1H) pesa 1,00782. L'acqua pesa quindi circa 18 (18,0104541).

Alcune definizioni Massa Nominale: Massa Esatta: Peso Atomico: e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento.   Massa Esatta: e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C. Peso Atomico: (quello usato in stechiometria, per intendersi): e' la media ponderale delle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolare elemento.

Relative Isotope Abundance of Common Elements: Relative  Abundance Carbon 12C 100 13C 1.11 Hydrogen 1H 2H .016 Nitrogen 14N 15N .38 Oxygen 16O 17O .04 18O .20 Sulfur 32S 33S .78 34S 4.40 Chlorine 35Cl  37Cl 32.5 Bromine 79Br 81Br 98.0

Quali sono i componenti di uno spettrometro di massa? Sistema di introduzione rivelatore analizzatore Sorgente ionica

Spettro di massa                                                                                                                                                                          

Modalità di ionizzazione Hard Ionization: Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

Ionizzazione Elettronica

Sorgente ionizzazione elettronica (EI)

Ionizzazione elettronica (EI) Nella camera di ionizzazione le molecole del campione da analizzare, in fase gassosa, interagiscono con un fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (Renio o Tugsteno) ed accelerato attraverso un potenziale regolabile dall'operatore. L'energia del fascio e' normalmente fissata a 70 eV.   La relazione tra il momento di un elettrone - considerato come particella - e la sua lunghezza d'onda e' fornita dall'equazione di De Broglie: lambda=h/mv Agli elettroni di 70 eV impiegati per la ionizzazione puo' quindi essere associata una lunghezza d'onda di ca. 1.4 Å. Durante l'avvicinamento degli elettroni alla molecola bersaglio, l'onda elettronica ed il campo elettrico molecolare interagiscono tra di loro con una mutua distorsione. L'onda elettronica distorta puo' esere considerata composta da un insieme di radiazioni di differente lunghezza d'onda, alcune delle quali hanno la frequenza corretta per interagire con gli elettroni della molecola. In termini quantomeccanici l'impatto elettronico puo' quindi promuovere eccitazioni elettroniche simili a quelle osservate nella spettroscopia UV, fino ad ottenere anche l'espulsione di un elettrone dalla molecola con formazione di uno ione radicale positivo, lo Ione Molecolare M(.+): e- + M ---> M.+ + 2e-

Interpretazione dello spettro di massa   Nella comune pratica di laboratorio, si suggerisce prima di tutto di eseguire un confronto computerizzato dello spettro appena registrato con il vasto archivio di spettri ormai disponibile su tutti gli spettrometri commerciali. Anche se la molecola esaminata non e' compresa nell'archivio, l'elaboratore elenca una serie di composti che contengono il maggior numero possibile di ioni comuni con lo spettro incognito. L'identificazione di ioni caratteristici e' uno stadio importante anche nell'interpretazione "manuale" degli spettri di massa: l'aiuto di un computer quindi non guasta. Nell'interpretazione non assistita, normalmente si segue una procedura abbastanza semplice: 1.Identificazione dello ione molecolare. 2.Identificazione di ioni caratteristici. 3.Identificazione di processi di frammentazione caratteristici.

Ione molecolare M + e- ----> M*+ + 2e- E' lo ione (positivo) generato per ionizzazione della molecola da analizzare. Dopo ionizzazione per impatto elettronico e' una specie a numero dispari di elettroni:   M + e- ----> M*+ + 2e- Non necessariamente e' osservabile nello spettro. Ad esempio negli alcoli alifatici a lunga catena e' di regola assente. Spesso e' possibile osservare ioni molecolari piu' intensi riducendo l'energia del fascio elettronico di ionizzazione. Metodi alternativi di ionizzazione producono ioni molecolari piu' intensi e relativamente meno ioni frammento. Lavorando ad alta risoluzione, la massa esatta dello ione molecolare fornisce direttamente la composizione elementare del composto incognito. Esistono delle regole generali: -         E' lo ione a massa più alta dello spettro. -         E' legato ad altri ioni attraverso perdite logiche -         Se la molecola contiene solamente C, H, O, S, Alogeni o un numero pari di atomi di azoto, lo ione molecolare e' di massa nominale pari. - Se la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto, la massa nominale dello ione molecolare e' dispari.

Spettro di massa CH3 C O CH2 Picco Base m/z 57 Ione Molecolare - 29 - 15

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Ionizzazione elettronica (EI) Vantaggi Spettri ben interpretabili La frammentazione fornisce informazioni di tipo strutturale Gli spettri sono riproducibili Svantaggi Per alcuni composti lo ione molecolare puo’ essere poco rappresentato o addirittua assente Applicabile solo a composti volatili, termostabili, neutri e con peso molecolare non elevato

Modalità di ionizzazione Hard Ionization: Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

Ionizzazione Chimica (CI)

Ionizzazione chimica Generalmente in uno spettrometro di massa la pressione e' mantenuta la piu' bassa possibile con efficienti sistemi di pompaggio (10-4 - 10-7 mmHg), e reazioni bimolecolari (es. ione-molecola) sono estremamente improbabili.   La ionizzazione chimica avviene invece se introduciamo nella camera di ionizzazione un gas reagente, ad esempio metano, in concentrazioni relativamente elevate (1 mmHg). Lo ione molecolare del metano generato per impatto elettronico puo' reagire con l'eccesso di metano: Il catione CH5+, è un acido forte, puo' quindi protonare con una reazione acido-base praticamente qualsiasi molecola organica. Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione pseudomolecolare (M+H)+ con un bassissimo eccesso di energia vibrazionale, e le reazioni di frammentazione sono quindi poco importanti.  

[M+H]+ M•+

Modalità di ionizzazione Hard Ionization: Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

The Nobel Prize in Chemistry 2002 “For the development of methods for identification and structures analysis of biomolecules” Electrospray Ionization Laser Desorption

Ionizzazione Elettrospray (ESI)

Ionizzazione elettrospray Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione atmosferica Ionizzazione delicata Molecole di polarità medio-alta Composti con basso ed alto PM fino a 150.000 Spesso si formano ioni con carica multipla Comune la presenza di ioni addotto La fase mobile deve essere polare

Dettaglio dell’ugello elettrospray Guaina di N2 Sonda riscaldata ESI Ago ESI Pennacchio di ioni ±5 kV Gas di nebulizzazione N2

Meccanismo dell’elettrospray Goccioline contenenti ioni Capillare ±5 kV Col procedere dell’evaporazione delle goccioline, il campo aumenta e gli ioni si muovono verso la superficie Raggiungimento del limite di Raleigh ed esplosione coulombica che rilascia gli ioni

Ionizzazione elettrospray

Ionizzazione elettrospray

ESI-MS Spectrum of Metamidophos 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 % [M+H]+ 142 [M+Na]+ 164 [M+K]+ 181 Ione Pseudomolecolare Nessuna Frammentazione Formazione di Addotti con ioni Na e K

EI-MS Spectrum of Metamidophos

ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da) 661.26 715.99 786.97 859.66 955.00 1073.07 +13 +12 +11 +10 +9 +8 Nessuna Frammentazione Formazione di Ioni Multicarica

Spettro Deconvoluto dell’Ubiquitina Ubiquitina Intatta Ubiquitina Ossidata 8563.63 8580.00 Ubiquitina Carbossilata 8594.25

Prestazioni Generali della Sorgente ESI Vantaggi Funziona bene con analiti volatili e non volatili, ionici e/o polari Informazioni sul peso molecolare Scarsa frammentazione Elevata sensibilità Permette la determinazione di alti pesi molecolari Interfacciamento con Cromatografia Liquida Svantaggi Scarsa frammentazione Non compatibile con l’utilizzo di tamponi non volatili e solventi organici apolari. Ionizzazione inibita da alte concentrazioni saline

Ionizzazione Chimica a Pressione Atmosferica (APCI)

Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Composti a più basso peso molecolare PM <1000 Formazione di ioni con carica singola Più energetica Maggiore potenzialità di frammentazione La fase mobile può essere non polare Cromatografia in fase normale Sono favoriti i composti con bassa polarità

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) La APCI sfrutta i vapori di solvente che accompagnano l’analita durante l’eluizione cromatografica dopo un rapido riscaldamento, per produrre su di essi la prima ionizzazione mediante un elettrodo a corona. Le molecole di solvente ionizzate si comportano poi da reagente per la ionizzazione chimica degli analiti, in modo analogo a quanto avviene per la ionizzazione chimica tradizionale in GC-MS.

Meccanismo di generazione degli ioni in APCI Nebulizzatore riscaldato Molecole del campione Molecole del solvente Liquido + Ago corona Aerosol Molecole del campione solvatate Solvente ionizzato Campione ionizzato Trasferimento di carica N2 APCI - technique overview The sample, in solution, is carried through the probe via a 100µm i.d. fused silica capillary. The capillary is surrounded by a sheath which directs a flow of nitrogen nebulising gas past the liquid eluting from the capillary. The sample elutes into a region of the nebuliser which is heated. The action of the nebuliser gas and the heated probe cause the liquid to form an aerosol which is then vaporised. In contrast to Electrospray, Ionization has not yet taken place. This happens as the aerosol leaves the heated nebuliser region. A corona pin is mounted separately from the nebuliser and a voltage of approximately 3kV is applied to it. The discharge produced by this high voltage causes solvent molecules eluting into the source to be ionised. In the atmospheric pressure region around the corona pin, a combination of collisions and charge transfer cause a region of a low-energy reagent gas plasma to be formed. Any sample molecules which elute and pass through this region of solvent ions can be ionised by the transfer of a proton to form [M+H] or [M-H]-. This is a form of chemical Ionization taking place, hence the name of the technique. A flow of warm nitrogen gas through the source helps the evaporation process and removal of the solvent as in Electrospray. This is known as the drying gas.

Dettaglio dell’ugello APCI Guaina gassosa N2 Sonda riscaldata APCI Capillare APCI (ritratto) Pennacchio ioni ±5 kV Ago corona Plasma ioni Gas di nebulizzazione N2

“Corona Discharge” Meccanismo Ioni Positivi L’ago cattura elettroni formando ioni N2+, O2+, H2O+… (ioni primari). Gli ioni primari, aventi un tempo di vita molto breve, trasferiscono la carica al solvente, formando principalmente ioni H3O+, NH4+, RH2O+…(ioni reagenti). Gli ioni reagenti trasferiscono la carica all’analita, formando prevalentemente specie [M+H]+.

“Corona Discharge” Meccanismo Ioni Negativi L’ago rilascia elettroni formando ioni O3-, O2-, NO2-, CO3-…(ioni primari). Gli ioni primari, aventi un tempo di vita molto breve, trasferiscono la carica al solvente, formando principalmente ioni OH-, HCO3-, RO-… (ioni reagenti). Gli ioni reagenti trasferiscono la carica all’analita formando prevalentemente specie [M-H]-.

ESI-APCI: confronto del processo di ionizzazione

APCI: sommario delle caratteristiche La APCI è adatta a composti anche non particolarmente polari, che possono essere in forma ionica in soluzione, ma non sono tipicamente acidi o basi forti. Il pH non ha una grossa influenza sulla risposta. Il flusso utilizzabile in APCI va da 0.2 a 2 ml/min. Un tipico flusso operativo è 1 ml/min. In condizioni APCI il parametro da fissare è la corrente di scarica, generalmente limitata a 2-3 µA. Questo valore induce un voltaggio sull’ago paragonabile a quello normalmente impiegato per la ionizzazione electrospray. La APCI non porta in nessun caso alla formazione di ioni multicarica.

Campo di applicazione Composti di bassa o media polarità, volatili o semivolatili. In certi casi la APCI offre una sensibilità maggiore dell’ESI, specialmente quando vengono utilizzati tamponi. In generale, la APCI può essere considerata complementare rispetto all’ESI e all’APPI.

Fast Atom Bombardment (FAB) e Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) FAB e SIMS sono tecniche in cui il campione è bombardato da una corrente di atomi/molecole neutri oppure di ioni. E’ indispensabile che il campione sia sciolto in una matrice. Questa è una tecnica eccellente per l’analisi in tracce ed è usata nall’analisi dei peptidi, nucleotidi, carboidrati e piccole molecole polari.

Ionizzazione Laser Assistita da Matrice (MALDI)

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Il desorbimento mediante laser permette di ottenere ioni in fase gassosa. Le pulsazioni provenienti da un laser a 106-1010 W/cm2 sono focalizzate sulla superficie del campione solido. Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e creano un microplasma di ioni e di molecole neutre che possono reagire tra di loro in fase vapore. Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare sia di ionizzare il campione.

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Principi operativi I passaggio: il composto è mescolato ad una matrice che assorbe intensamente la lunghezza d’onda del laser. La miscela è asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne risulta una soluzione solida costituita da analita e cristalli di matrice.

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione solida ed inducono il riscaldamento della soluzione e la sublimazione della matrice. Una certa energia è trasferita alle molecole di analita che si ionizzano. Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione di analiti ad altissimo PM (>100000 Da). E’ usato nell’analisi di proteine ad alto PM, polimeri e biopolimeri.

1. Sample is mixed with matrix and dried on a sample plate 2. Sample plate is introduced into MALDI source 3. Sample spot is irradiated with laser + To Time of Flight LD consente solo il desorbimento e la ionizzazione di molecole con MW pari a 1000Da per i biopolimeri e 9000 Da per i polimeri sintetici

MALDI PROCESS Irradiation H+ Proton transfer Desolvation Desorption Sample Molecules are ionized by proton transfer from the matrix Matrix Sample

MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C, Ubiquitin and Myoglobin

Matrix Selection Solubility in sample-solvent system Absorption at the laser wavelenght Photostability Volatility Reactivity Alcune matrici possono ossidare i ponti a disolfuro ed i residui di cisteina e metionina-le aldeidi reagiscono con i gruppi amminici

Matrix Application a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates Sinapinic acid (SA) Peptides and large proteins (10-150KDa), glycoproteins, membrane proteins Gentisic acid Peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids, polymers, lipids, organic molecules Trans-3-indoleacrylic acid (IAA) Synthetic polymers 3-hydroxypicolinic acid (HPA) Oligonulceotides > 3.5KDa 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Oligonucleotides < 3.5KDa Dithranol (DIT) Polymers

Prestazioni Generali della Sorgente MALDI Advantages: Analysis of compounds with a MW in excess of 300000 Da High Sensitivity (from 100 fmol to 2 pmol No multicharged Ions Tolerance towards the presence of salts, buffers, and or other additives Analysis of complex mixtures Disadvantages: Analysis of compounds with a MW below 600 Da is difficult The resolution of TOF mass analyzer is limited No analysis of non-covalent complexes On-line coupling with an LC or CE equipment is very difficult.

Paragone tra tecniche di ionizzazione MS 200,000 ESI 15,000 1,000 APCI PM FAB EI/CI 10 NON POLARE MOLTO POLARE