UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CASSINO FACOLTA’ DI SCIENZE MOTORIE CORSO INTEGRATO DI BIOCHIMICA, BIOLOGIA & GENETICA MEDIA MODULO DI BIOLOGIA & GENETICA MEDICA I MICRORGANISMI: BATTERI & VIRUS AA 2011-2012 Dott.ssa Veronica Papa

La Microbiologia è la branca della Biologia che studia i microrganismi (= micros (piccolo), bios (vita) e logos (parola)) Microrganismi sono definiti come organismi unicellulari invisibili ad occhio nudo, a volte organizzati in aggregati pluricellulari senza differenziazione in tessuti od organi Sono coinvolti in importanti cicli della materia, trasformazioni geochimiche e processi biologici. Comparsi sul nostro pianeta oltre 3.5 miliardi di anni fa; costituiscono Oltre la metàdella biomassa contro il 35% piante e 15% animali

Concorrono all’equilibrio biologico sulla Terra. Sono responsabili delle malattie infettive nell’uomo, negli animali e nelle piante. Vengono chiamati in causa nell’insorgenza di alcuni tipi di tumori (HPV). Causa di degradazione degli alimenti. Utilizzati come modelli sperimentali per lo studio della genetica molecolare e della fisiologia cellulare e per la produzione di sostanze utili all’uomo (sieri e vaccini, antibiotici, vitamine ed altre sostanze utili).

I VIRUS Entità biologiche subcellulari Parassiti endocellulari obbligati Possiedono un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA) Hanno dimensioni piccolissime (sono filtrabili) Possiedono un involucro proteico (capside) e, a volte, un involucro lipoproteico(pericapsideo peplos) Presentano in superficie strutture proteiche (antirecettori) che si attaccano a specifici recettori della cellula bersaglio

I microrganismi possono essere classificati per: - Morfologia (dimensione, forma): Cocchi, Bacilli, Vibrioni e Spirilli. - Caratteristiche di colorazione), caratteristiche metaboliche e antigeniche Sulla base dei rapporti che questi contraggono con l'ospite: Saprofiti o Commensali: microrganismi che vivono e si moltiplicano a contatto con l'ospite senza provocare danni; anzi, a volte si può instaurare un rapporto di reciproco beneficio. Patogeni: microrganismi che tendono a provocare malattia. Opportunisti: microrganismi normalmente innocui, ma in grado di provocare malattie, anche gravi, in seguito ad un indebolimento delle difese dell'organismo.

Un individuo sano vive in armonia con la flora microbica che lo aiuta a proteggersi dall'invasione degli agenti patogeni. Le specie che costituiscono la flora normale sono influenzate da molti fattori (p.es., dieta, igiene personale, condizioni sanitarie). Es: i lattobacilli sono dei comuni organismi intestinali commensali frequenti nei soggetti con un alto consumo di latticini; l'Haemophilus influenzae colonizza l'albero tracheobronchiale nei pazienti che presentano malattia polmonare cronica ostruttiva (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD). I microrganismi patogeni possono a volte far parte della flora normale specialmente nei pazienti le cui barriere difensive siano alterate.

SFERICI: Streptococcus pneumoniae

BACILLI

SPIRILIFORMI VIBRIO CHOLERAE

STUTTURA DI UNA CELLULA PROCARIOTICA Capsula: involucro di protezione e adesione alle superfici Parete cellulare: rivestimento rigido di protezione e sostegno; consente il mantenimento della forma Membrana plasmatica: circonda la cellula e regola il traffico delle molecole Nucleoide: regione contenente il materiale ereditario (DNA) Plasmidi: porzioni di DNA che posseggono le proprietà di un cromosoma Ribosomi: organuli preposti alla sintesi proteica Pili: strutture per l’ancoraggio Flagelli: strutture per il movimento Respirazione: associata alla membrana

LA PARETE CELLULARE Complessa struttura rigida presente solo nei procarioti che conferisce la forma al batterio e ne garantisce la protezione dall'ambiente esterno. La parete dei Gram-positivi è costituita principalmente da una spesso e stratificato strato rigido di peptidoglicano. I batteri Gram-negativi hanno uno strato piu‘ sottile di peptidoglicano e una membrana esterna.

LA CAPSULA Involucro denso esterno alla parete, di natura polisaccaridica o proteica, presente sia dei batteri Gram+ che Gram- Se poco aderente e poco uniforme per densità e spessore èdefinto glicocalice. Previene l’essicamento Favorisce l’adesività ad altri batteri e alle superfici dei tessuti dell’ospite Favorisce la colonizzazione in particolari distretti biologici. Ha proprietà antifagocitaria impedendo il riconoscimento tra cellula fagocitaria ed il batterio. Mutanti di batteri normalmente capsulati che hanno perso la capacità di formare la capsula perdono la virulenza Funge da barriera alla diffusione degli antibiotici.

FLAGELLI I flagelli sono organi di movimento, cioè conferiscono motilità ai batteri. Consentono un movimento orientato (chemiotassi positiva o negativa in risposta a stimoli fisici quali luce e calore e chimici quali nutrienti o sostanze dannose). Sono costituiti da flagellina, una proteina contrattile e sono formati da un unico filamento sprovvisto di membrana. Possono essere persi e rigenerati e la loro sintesi è regolata da almeno 20 geni.

Sono strutture proteiche rigide (0,2-20 μm) presenti soprattutto nei Gram-sulla superficie esterna della cellula. I pili comuni, spesso codificati da plasmidi, sono presenti in gran numero (anche fino a 1000 per cellula) Mediano l’adesione e l’aggregazione batterica, quindi favoriscono la colonizzazione e la formazione di pellicole superficiali PILI (FIMBRIE)

DIVISIONE DELLA CELLULA BATTERICA La divisione di una cellula batterica in due cellule figlie avviene mediante scissione binaria, un processo che si realizza attraverso: l’estensione della parete la replicazione del materiale genetico, costituito nel caso dei batteri da un’unica molecola circolare di DNA (cromosoma batterico)ancorata alla membrana citoplasmatica la formazione del setto.

La riproduzione inizia con la replicazionedel DNA; le 2 nuove molecole vengono separate dal setto (2 membrane separate da 2 strati di peptidoglicano, neo-sintetizzati), che inizia a formarsi dall’esterno verso il centro, separando le 2 cellule figlie. L’ancoraggio del DNA alla membrana trascina il cromosoma duplicato nella nuova cellula. Il tempo di divisione (tempo di generazione) varia a seconda dei batteri, da 20 minuti (Escherichiacoli) a diverse ore (Micobatteri).

SPORE Prerogativa di alcuni gram-positivi Strutture protettiva in cui il batterio sopravvive in uno stato di quiescenza, una forma di resistenza metabolicamente inattiva. Non è una modalità di riproduzione batterica Viene prodotta in risposta a condizioni ambientali avverse; se le condizioni ambientali migliorano danno luogo alle forme vegetative (germinazione). Resiste all’essiccamento, alle radiazioni gamma e ultraviolette Sopravvive al calore (anche > 100°C)

Il materiale genetico presente nella cellula batterica è costituito dall’insieme di tutti i geni presenti sia nell’unico cromosoma che negli elementi extracromosomici trasmissibili L’unico cromosoma batterico è costituito da una molecola di DNA circolare a doppio filamento e presente in una unica copia (aploidia) i plasmidi, elementi genetici extracromosomici presenti in unica o molte copie autonomi rispetto al cromosoma batterico e generalmente trasmissibili da una cellula all’altra. Contengono informazioni importanti ma non indispensabili alla sopravvivenza: produzione di tossine, pili, adesine, enzimi che conferiscono resistenza ai farmaci antibatterici.

RICOMBINAZIONE GENETICA La ricombinazione è un processo unidirezionale mediante il quale una porzione di materiale genetico (DNA) è trasferita da un donatore ad una cellula ricevente che la integra nel suo cromosoma, attraverso processi di scambio di sequenze omologhe, con acquisizione di nuove caratteristiche fenotipiche. Il trasferimento di materiale genetico tra 2 cellule batteriche e consiste nello scambio di porzioni omologhe fra 2 molecole di DNA di 2 differenti batteri. Può avvenire tramite: - Trasformazione - Trasduzione - Coniugazione

La trasformazione: acquisizione di nuovi marcatori genetici attraverso l’incorporazione di DNA esogeno La trasduzione: Alcuni virus batterici (batteriofagi) possono trasferire geni batterici da una cellula all’altra. La coniugazione: trasferimento diretto di materiale genetico cromosomico attraverso un contatto fisico tra due cellule, possibile solo se il batterio possiede particolari plasmidi, detti appuntoplasmidi coniugativi che generano la sintesi del pilo F.

TRASFORMAZIONE Condizioni necessarie sono: - La presenza di DNA libero. - Stato di competenza della cellula ricevente. La cellula è normalmente impermeabile al DNA, a meno che non si trovi in uno stato di competenza (formazione di pori transitori nella membrana che permettono il passaggio di molecole di DNA). A questo punto i frammenti di DNA entrano, si appaiano e possono ricombinarsi (a sinistra)

CRESCITA BATTERICA Fase di latenza: le cellule aumentano di volume ma non di numero: i batteri si adattano al nuovo ambiente. Fase esponenziale o logaritmica: i batteri si moltiplicano con un tempo di duplicazione che dipende dal ceppo e dall’ambiente. Fase stazionaria: i batteri smettono di crescere per la mancanza di metaboliti e l’accumulo di sostanze tossiche. Fase di morte cellulare: la fase di declino o morte cellulare si manifesta come riduzione lineare del numero di cellule vitale nel tempo.

CARATTERISTICHE DEI VIRUS Entità biologiche subcellulari (virione: particella virale completa ed infettante) Parassiti endocellulari obbligati (di animali, piante, funghi, batteri) (non possono produrre energia o sintetizzare acidi nucleici e proteine al di fuori di una cellula ospite) Hanno dimensioni piccolissime (sono filtrabili) Possiedono un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA) Possiedono un involucro proteico (capside) e, a volte, un involucro lipoproteico(pericapsideo peplos) Presentano in superficie strutture proteiche (antirecettori) che si legano a specifici recettori della cellula bersaglio Alcuni possiedono propri enzimi complessi ma, senza assistenza, non sono capaci di riprodurre le informazioni contenute nei loro genomi

DEFINIZIONE E PROPRIETÀ DEI VIRUS Non sono esseri viventi Per esistere in natura devono essere infettanti Devono utilizzare i meccanismi della cellula ospite per produrre i propri componenti (mRNA virali, proteine e copie identiche del genoma) Devono codificare proprie proteine specifiche per ogni processo da loro richiesto e non effettuabile dalla cellula La produzione di nuovi virioni avviene per assemblaggio delle componenti virali

CAPSIDE Rivestimento proteico (fino al 90% del virione) Fornisce protezione all'acido nucleico È importante per l’infettività (strutture anti-recettoriali) Dal momento che il genoma virale ha un numero limitato di geni, il capside è costituito dalla associazione di subunità proteiche in protomeri ripetuti (capsomeri) collegati da legami tra gruppi chimici presenti sulla superficie e auto assemblanti

LA FUNZIONE DEI RIVESTIMENTI ESTERNI 1) Protezione del fragile genoma da danni fisici, chimici, enzimatici. I capsidi sono formati da un certo numero di unità proteiche uguali. Il danno ad una rende quell’una non funzionale, ma difficilmente danneggia l’intera particella. Questo fa del capside un’efficace barriera. 2)Conferimento della capacitàdi riconoscimento con il recettore cellulare. 3)Penetrazione del genoma virale nella cellula in una conformazione con la quale può interagire con le strutture cellulari ed iniziare il processo infettivo - in alcuni casi questo è un processo facile che consiste semplicemente nel far entrare il genoma nel citoplasma -in altri casi invece, questo momento è più complesso. Per es. i Retrovirus

MORFOLOGIA E STRUTTURA Il modo in cui i diversi componenti sono organizzati nella struttura del virione è stato chiarito mediante microscopia elettronica Le catene polipeptidiche che costituiscono il capside sono disposte in modo simmetrico e la morfologia risultante del virione è variabile: rotondeggiante, allungata (a bastoncino), complessa, pleiomorfa.

BATTERIOFAGI

IL GENOMA DEI VIRUS 70% dei virus animali ha un genoma ad RNA quasi sempre a singolo filamento 4 –18 proteine 30% dei virus animali ha un genoma a DNA. L’acido nucleico di quasi tutti i virus a DNA è a doppio filamento ma in alcuni è parzialmente a singolo filamento quando non è in fase di replicazione - 3 –100 proteine

FASI DELLA MOLTIPLICAZIONE VIRALE Nella fase di parassitismo intracellulare il virus perde le caratteristiche morfologiche della fase extracellulare Acido nucleico e proteine strutturali della progenie virale sono sintetizzati separatamente in un gran numero di copie, poi assemblati in virioni maturi al termine del ciclo di moltiplicazione Il ciclo moltiplicativo si divide in 5 fasi 1. Adsorbimento 2. Penetrazione 3. Esposizione dell'acido nucleico 4. Sintesi dei componenti virali 5. Assemblaggio e fuoriuscita dei virioni dalla cellula infetta

PENETRAZIONE DI VIRUS PRIVI DI RIVESTIMENTO Micropinocitosi (adsorbimentoendocitico, viropessi) meccanismo più frequente: lo stesso che le cellule usano per internalizzare sostanze corpuscolate al di sotto di 1 μm (introflessioni della membrana rivestite di clatrina con successiva fusione con lisosomi) (1); in qualche caso entra solo l’acido nucleico (2)

PENETRAZIONE DI VIRUS CON RIVESTIMENTO 1. Fusione -lipidi e proteine del peplos si fondono con quelli della membrana della cellula, il nucleo capside viene a trovarsi direttamente nel citoplasma (in alcuni virus una specifica glicoproteina F del peplos favorisce la fusione) 2. Endocitosi - tutto il virus viene inglobato in una vescicola endosomica