STERILIZZAZIONE Processo che si prefigge di distruggere su un substrato o in un determinato ambiente tutte le forme di vita, spore comprese.  La sterilizzazione è perseguibile con: MEZZI FISICI MEZZI CHIMICI Filtrazione Calore Radiazioni

STERILIZZAZIONE CON IL CALORE Il calore è considerato il mezzo più sicuro, rapido ed economico per qualsiasi materiale che non sia termolabile. Il tempo di sterilizzazione decresce con l’aumentare della temperatura.  Il calore può essere usato essenzialmente in due modi: SECCO UMIDO

In entrambi i casi l’azione biocida del calore deriva dall’ossidazione dei costituenti cellulari con denaturazione irreversibile degli enzimi e delle strutture proteiche. La sensibilità del calore varia in rapporto al loro contenuto in H2O: più questa è alta, più sensibili sono i microrganismi al calore.

La sterilizzazione con il calore può essere ottenuta usando: incenerimento CALORE SECCO Stufa di Pasteur ebollizione CALORE UMIDO autoclave (vapore saturo)   Il principio fisico che sta alla base dei due diversi metodi è che il vapore è un migliore conduttore termico rispetto al calore secco, cioè: a parità di temperatura, la sterilizzazione è raggiunta in un tempo minore.

CALORE SECCO Si usano le Stufe Pasteur o a secco in cui il calore si trasmette per convezione o irraggiamento dalle pareti della stessa. Utile per materiale termoresistente, non corrode. Il tempo di morte termica nella stufa a secco è il seguente: 30’ a 180°C 50’ a 170°C 120’ a 160°C 150’ a 150°C I parametri di funzionamento sono 2: TEMPERATURA TEMPO

CALORE UMIDO Ebollizione E’ il metodo più semplice per la sterilizzazione dell’acqua e di oggetti in essa immersi o dei recipienti stessi. L’ebollizione va prolungata per almeno 20’

Vapore sotto pressione (autoclave) Si usa vapore saturo, sotto pressione. Il ciclo di base è 121° C per 15’ ad 1 atmosfera. Parametri di funzionamento dell’autoclave: temperatura tempo pressione

STERILIZZAZIONE CON LE RADIAZIONI RADIAZIONI IONIZZANTI I raggi g (gamma) sono fotoni ad elevata energia. Le radiazioni ionizzanti agiscono trasferendo la loro energia all’interno della cellula colpita, la cui sensibilità è proporzionale alla quantità di DNA presente, che viene alterato. Tutto materiale di plastica sterilizzato con radiazioni gamma.

RADIAZIONI ULTRAVIOLETTE (UV) Le radiazioni UV sono radiazioni elettromagnetiche prodotte dal bombardamento, con elettroni o con un fascio di raggi catodici, di un bersaglio di metallo pesante (lampade germicide).

I RAGGI UV Risultano poco penetranti ed agiscono per trasformazione fotochimica delle basi pirimidiniche del DNA cellulare. La sterilizzazione con i raggi UV è adoperata soprattutto nei laboratori scientifici per trattare l’aria. Il tempo di esposizione può essere permanente e l’esposizione deve avvenire quando i locali trattati non sono utilizzati. Questo perché i raggi UV sono molto irritanti per le mucose (occhi in particolare).

Cappe a flusso laminare (o cabine di sicurezza biologica) Alcune delle tecniche di laboratorio possono inavvertitamente generare schizzi ed aerosol; le cabine di sicurezza biologica sono attrezzature che agiscono come barriere, eliminando o riducendo il rischio di infezioni via aria impedendo la diffusione degli aerosol e degli schizzi verso l’operatore e l’ambiente esterno e nello stesso tempo garantiscono la sicurezza del campione prevenendo contaminazioni esterne e crociate.

Flusso laminare: flusso unidirezionale di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,45 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici, quindi il flusso d’aria viene “raddrizzato” generando un flusso d’aria laminare, ossia unidirezionale e privo di turbolenze. Filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 µm di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%.

Cappa a flusso laminare verticale A. Aria contaminata in uscita B. Schermo Frontale C. Filtro HEPA D. Motoventilatore

Buona prassi di lavoro   Spegnere sempre la lampada U.V. in presenza dell’operatore; anche se quest’ultimo è presente nella stanza in cui è situata la cappa Accendere la cappa almeno 10 min prima di iniziare a lavorare Posizionare il vetro frontale, se del tipo a scorrimento, all’altezza di sicurezza per l’operatore (20-30 cm) Ridurre al minimo il materiale sul piano di lavoro Operare nella parte media e posteriore del piano di lavoro Evitare l’utilizzo di fiamme: provocano turbolenze e possono danneggiare il filtro HEPA; evitare movimenti bruschi; non inserire altro materiale a lavoro iniziato Rimuovere immediatamente rovesciamenti di materiale biologico A lavoro terminato, lasciare la cappa in funzione per 10 min, per “pulire” una eventuale aerocontaminazione dispersa Pulizia e disinfezione della cappa ogni volta che si termina il lavoro Chiudere la cappa, accendere la lampada U.V.

Colture di cellule di mammifero in sospensione in monostrato colture primarie linee continue: immortalizzate e tumorali

Mentre le cellule di procarioti hanno tempi di duplicazione brevi (circa 20-30 min), le cellule di mammifero hanno tempi di duplicazione lunghi (in media circa 12-24h)

L’ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi, lieviti, muffe. In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in quanto il microorganismo è meno visibile e richiede un paio di settimane per formare colonie visibili. Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al terreno (es: streptomicina-penicillina); va ricordato che sono stabili per pochi giorni a 37°C.

Contaminants (100X)

Types of Cells Cultured cells are usually described based on their morphology (shape and appearance) or their functional characteristics. There are three basic morphologies: Epithelial: cells that are attached to a substrate and appear flattened and polygonal in shape. 2. Lymphoblast: cells that do not attach normally to a substrate but remain in suspension with a spherical shape. 3. Fibroblast: cells that are attached to a substrate and appear elongated and bipolar, frequently forming swirls in heavy cultures. It is important to remember that the culture conditions play an important role in determining shape and that many cell cultures are capable of exhibiting multiple morphologies.

The Caco-2 cell line is a continuous cell of heterogeneous human epithelial colon adenocarcinoma

Cellule in sospensione

Il mezzo extracellulare 1) Fase gassosa 2) Temperatura 3) Terreno di coltura 4) Substrato di adesione

pH of medium: 7.2/7.4 1) Fase gassosa Saturazione umidità CO2 is normally produced by cells CO2 is fed to incubator by tank: 5% HCO3- (bicarbonate) is present as a result of the buffer salt and as a result of CO2 dissolved in the medium. pH of medium: 7.2/7.4

Il sistema tampone più comunemente utilizzato è bicarbonato/acido carbonico Il pH viene monitorato aggiungendo un indicatore come il rosso fenolo (giallo a pH acido, rosso-viola a pH alti).

Red dye indicates pH Reddish-pink = 7.2 – 7.4 Purple = too basic (CO2 concentration is too low) CO2 feed to the incubator needs to be adjusted contamination Humidity too low Dead cells Yellow = too acidic (CO2 concentration is too high) Cells need to be re-fed Bacterial contamination

2) Temperatura Le cellule di mammifero crescono a 37°C, sature di umidità, in un mezzo tamponato a pH ~7.3.

Basic Culture Medium 3) Terreno di coltura Amminoacidi Vitamine Sali Glucosio Indicatore Basic Culture Medium

Basic Culture Medium (IMDM) Add: 1) Antibiotics 2) Serum 3) Glutamin TERRENO COMPLETO

4) Substrato di adesione Plastica di 2 tipi: Treated: per tissue colture Un-treated: per suspension NB: l’aspetto delle piastre è identico, leggere sempre con attenzione sulla confezione!!!

Culture Dishes (plates) and Flasks Capped vessels Geometria del collo per ridurre rischi Harder to manipulate cells in vessel Students most often forget to loosen cap to allow air into vessel Well-plates Multiple areas for experiments with multiple variables 6, 12, 24, 48, 96 well plates Dishes Easy to manipulate cells Large surface area could create evaporation issues Easier to spill or contaminate

Esercitazione di oggi

1) Scomplementazione del siero 2) Preparazione terreni (compl, HAT,…) 3) Conta cells 4) Piastrare cells: mieloma e B16

Scomplementazione del Siero Alla fine del 1800 Nuttal aveva capito che era presente qualcosa di litico nel siero degli animali o delle persone immunizzate. Nel siero c’era un’attività termolabile, in grado di lisare i batteri, quando gli animali erano sensibilizzati contro quei batteri. Scaldando mezz’ora a 56°C, veniva persa la capacità di uccidere i batteri. Ciò significa che nel siero è presente una componente termolabile, unitamente ad una componente termostabile (ovvero, gli anticorpi).

L’esperimento era fatto in questo modo: venivano presi dei batteri, e del siero iperimmune (ovvero da un animale immunizzato più volte) verso i batteri, tale siero uccideva i batteri. Tale siero perdeva la sua attività litica con un riscaldamento a 56°C per mezz’ora. Un altro siero proveniente da un animale non immunizzato non uccide ovviamente i batteri, ma è capace di "complementare" l’attività litica del siero scaldato. - termolabile, ed aspecifica - termostabile, specifica Quella termolabile è data appunto dalle proteine del complemento, quella termostabile è data invece dagli anticorpi.

Scomplementazione del siero Incubare il siero nel bagnetto a 56°C per 30 minuti. Dopo l’incubazione filtrare il siero scomplementato con un filtrino da 0,2 µm. Per questa operazione bisogna versare il siero in una siringa da 5 ml in cui è stato precedentemente sostituito l’ago con l’apposito filtrino (di colore blu).

Conc. Iniziale Conc. Finale 2) Terreni di coltura Terreno IMDM 10% FBS o “Terreno Completo” Terreno (IMDM) vol. Tot 2 x 50 ml Conc. Iniziale Conc. Finale Penicellina/streptomicina 100x 1x L- Glutammina 200mM 2mM FBS 100% 10%

Conc. Iniziale Conc. Finale Terreno Selettivo HAT completo Terreno (IMDM o DMEM) vol. Tot. 50 ml Conc. Iniziale Conc. Finale Penicellina/streptomicina 100x 1x L- Glutammina 200mM 2mM FBS 100% 10% HAT 50x

3) CONTA delle CELLULE: Centrifugare le sospensione cellulari fornite a 1200 rpm per 5 minuti buttare via il surnatante con una pipetta da 10 ml (facendo bene attenzione a non toccare il pellet cellulare), lasciando circa 3-4 mm di supernatante Risospendere le cellule “picchettando” con un dito il fondo della falcon Aggiungere 1 ml di terreno completo Prelevare sterilmente 10 µl di sospensione cellulare e fare le opportune diluizioni (1:5) Prelevare 10µl del campione cellulare diluito Con la Gilson P20, mettere 10 µl nella camera di conta Contare almeno 3 quadranti

Esempio: Ponendo come diluizione X, prelevando 10µl del campione cellulare, una volta contate le cellule e fatta la media matematica il calcolo da fare per sapere il n° di cellule/ ml sarà: x (Numero medio di cellule per quadrante) x fattore di diluizione finale 10-4 ( volume del quadrante) A questo punto calcolare il numero di cellule necessario da piastrare, aggiungervi un opportune volume di terreno fresco e piastrare secondo le indicazione nelle piastre opportune.