Analisi e Simulazione di Cellule Eccitabili mediante Automi Ibridi Relatore: Dott. Ezio Bartocci Dipartimento di Matematica e Informatica Università di Camerino In collaborazione con Prof.ssa Emilia Entcheva, Prof. Radu Grosu, Prof. Scott A. Smolka State University of New York at Stony Brook La locuzione latina in silico, tradotta letteralmente, significa nel silicio. La locuzione, comparsa di recente in letteratura scientifica, è usata per indicare fenomeni biologici riprodotti in una simulazione matematica al computer, invece che in provetta o in un essere vivente. Infatti il silicio, è la sostanza di cui sono fatti i componenti elettronici all'interno della quasi totalità dei computer, anche se il concetto di simulazione matematica non ha niente a che fare con il silicio. Al contrario, se il fenomeno biologico si riproduce in provetta, si dice "in vitro", mentre se si riproduce in un essere vivente si dice "In vivo". La ricerca scientifica in silico è ovviamente il frutto della recente informatizzatione della ricerca. In biologia hanno assunto un importanza fondamentale le basi di dati che contengono i dati di sequenziamento del DNA e i livelli di espressione genica di un gene. Inoltre sono stati creati numerosi programmi informatici per l'analisi e l'interpretazione di dati sperimentali. La ricerca in silico consiste dunque nell'uso di tali programmi e raccolte di dati allo scopo di ricavare nuove informazioni dalla comparazione, interpretazione, analisi ed interconnessione dei dati.

Sommario Background biologico Motivazione Background computazionale Automi Ibridi (AI)‏ Modelli AI di Cellule Eccitabili Dal Modello all'Applicazione Risultati di Simulazione Conclusioni

Background biologico Cellule Eccitabili Neuroni Miociti cardiaci Cellule muscolo-scheletriche Differenti concentrazioni di ioni all’interno e all’esterno delle cellule formano: Il potenziale di trans-membrana Correnti ioniche attraversano la membrana cellulare percorrendo particolari canali.

Assone gigante di calamaro (Animazione dal Laboratorio Biologico della Marina, MA)‏ Il calamaro a riposo Apre il mantello. L’acqua entra nella cavità del mantello Un segnale dal cervello viene mandato al ganglio stellato che è connesso alle cellule nervose (assoni) distribuiti lungo il mantello. Gli impulsi nervosi percorrono la lunghezza di questi assoni. I muscoli si contraggono in maniera sincrona, rapidamente chiudendo il mantello. L’acqua è forzata fuori attraverso il sifone producendo un getto. The squid giant axon is the very large (up to 1 mm in diameter; typically around 0.5 mm) axon that controls part of the Atlantic squid's (Loligo pealei) water jet propulsion system. Squid use this system primarily for making brief but very fast movements through the water usually when escaping predators. Between the tentacles of a squid is a siphon through which water can be rapidly expelled by the fast contractions of the body wall muscles of the animal. This contraction is initiated by action potentials in the giant axon. Action potentials travel faster in a larger axon than a smaller one, and squid have evolved the giant axon to improve the speed of their escape response. This has obvious adaptive advantage when escaping from predators. In their Nobel Prize-winning work uncovering ionic mechanism of action potentials, Alan Hodgkin and Andrew Huxley performed experiments on the squid giant axon. The large diameter of the axon provided a great experimental advantage for Hodgkin and Huxley as it allowed them to insert voltage clamp electrodes inside the lumen of the axon. To this day, no experimental preparation has yielded greater accuracy in the measurement of action potential characteristics, and this is still widely used in such studies. Il ganglio è un punto di connessione tra diversi tipi di cellule nervose. La sua funzione è di snodo delle informazioni neuronali dal sistema sensitivo a quello motorio e viceversa. La parola è utilizzata anche in senso figurato per esprimere la funzione centrale di un oggetto in un sistema. he stellate ganglion is a ganglion formed by the fusion of inferior cervical ganglion and the first paravertebral ganglion. The clinical significance of these ganglion is that they may be cut in order to decrease the symptoms exhibited by Raynaud's phenomenon and hyperhydrosis (extreme sweating) of the hands. Injection of local anesthetics near the stellate ganglion can sometimes mitigate the symptoms of sympathetically mediated pain such as complex regional pain syndrome type I (reflex sympathetic dystrophy). Complications associated with a stellate ganglion block include Horner's syndrome, intra- arterial or intravenous injection, difficulty swallowing, vocal cord paralysis, epidural spread of local anaesthetic and pneumothorax. Blunt needling of the stellate ganglion with acupuncture needle is used in Traditional Chinese Medicine to decrease sympathetically mediated symptoms as well.

(WorldWide Anaesthetist & Univ. of British Columbia)‏ Miociti cardiaci (WorldWide Anaesthetist & Univ. of British Columbia)‏ Spazio tra le giunzioni Propagazione del Potenziale di Azione Miociti Cardiaci

Ioni e canali delle Cellule Eccitabili K+ Ca2+

Membrana attiva (BiologyMad.com)‏ - Membrana agisce da condensatore - Lo stimolo crea un Potenziale di azione - I canali controllano il potenziale Canali Ionici Pompe Ioniche

Potenziale di azione (AP) (HyperPhysics, Georgia State University)‏

Potenziale di Azione (AP) L'Azione Potenziale è causata dal movimento degli ioni positivi dentro e fuori della membrana cellulare. 6 fasi: Resting Stimulated Upstroke Early Repolarization Plateau Final Repolarization Stimulated

Proprietà di Restituzione dell'AP Le cellule eccitabili rispondono a stimoli di differente frequenza. Ciascun ciclo è composto da: Durata dell'Azione Potenziale (APD)‏ Intervallo Diastolico (DI)‏ Più lungo è il DI, e più lungo è l'APD

Proprietà di refrattarietà Assoluto Durante l'AP la cellula si trova in un periodo di refrattarietà Il periodo di refratarietà è definito in due modi : Periodo di refrattarietà assoluto Periodo di refrattarietà relativo Relativo

Aritmie (1) L'aritmia è un difetto di conduzione del cuore Classificazione Tachiaritmia o tachicardia se il battito aumenta in modo anomalo al di sopra di 100 al min Bradiaritmia o bradicardia se il battito rallenta al di sotto di 40-50 per min Fibrillazione Ventricolare

Aritmie (2)

(Hofstra University, NY)‏ Motivazione (1) (Hofstra University, NY)‏ Solo negli Stati Uniti ogni anno ci sono un milione di morti provocati da malattie cardiovascolari. Quasi il 25% di questi sono vittime della fibrillazione ventricolare (VF). Durante la VF, l’attività elettrica normale del cuore è mascherata da onde di attivazione ad alta frequenza, che portano a piccole e localizzate contrazioni fuori fase.

Motivazione (2)‏ Le terapie farmacologiche fino ad ora non hanno dato risultati. L'impianto di cardiodefibrillatori è attualmente il trattamento di maggior successo dei pazienti con fibrillazione ventricolare incontrollabile. Tale dispositivo è progettato per riportare il cuore al suo normale ritmo grazie ad un forte shock elettrico che termina qualsiasi attività elettrica fuori controllo.

Modelli matematici per l'Azione Potenziale Modello di Hodgkin-Huxley (HH) Potenziale di membrana per l’ assone gigante del calamaro sviluppato nel 1952 E’ l’ambiente di lavoro per i seguenti modelli Modello di Luo-Rudy (LRd)‏ Modello per le cellule cardiache del porcellino d’India (guinea pig) sviluppato nel 1991 Modello Neo-Natal Rat (NNR)‏ Sviluppato alla Stony Brook University dalla Prof.ssa Emilia Entcheva et al.

Andrew Fielding Huxley Premio Nobel in medicina nel 1963 Due premi Nobel Alan Lloyd Hodgkin *1914 +1998 Andrew Fielding Huxley *1917 Premio Nobel in medicina nel 1963 “per le loro scoperte concernenti i meccanismi ionici coinvolti nell’eccitazione e nell’inibizione nelle porzioni periferiche e centrali della membrana della cellula nervosa”

Membrana attiva Na+ K+ Na K L Dentro Fuori

Propagazione del potenziale di azione (BiologyMad.com)‏ Cellula nervosa assone Nodi Ranvier (canali ionici)‏ myelin stealth

Correnti nella membrana attiva Dentro Fuori Ist INa gNa gK gL C IL IC IK VNa VL VK

Il modello di Hodgkin-Huxley C: Capacità della cellula V: Voltaggio transmembrana gna, gk, gL: Conduttanza massima del canale m, n, h: Variabili di gate del canale ionico Ist: currente di stimolo

Background computazionale Cellule Eccitabili: neuroni, miociti cardiaci, cellule muscolo- scheletriche Sono tradizionalmente rappresentate da complessi sistemi nonlineari ODEs/PDEs. Molto accurate, ma anche molto compute-intensive. L'altro estremo sono i cellular automata. Molto efficienti, sono modelli puramente discreti ma mancano di catturare le caratteristiche essenziali della cellula.

Il nostro approccio Gli Hybrid automata sono una miscela di sistemi discreti e continui. I nostri risultati mostrano che gli HA possono essere utilizzati per modellare efficentemente i tipi di cellule eccitabili preservandone le caratteristiche essenziali (la morfologia AP, la risposta al battito)‏ ll modello HA risulta essere all'incirca 10-volte più veloce nella simulazione di un tessuto di 400 x 400 cellule. I modelli HA sono accessibili all' analisi formale.

Che cosa è un Automa ? E’ un dispositivo o un suo modello in forma di macchina sequenziale, creato per eseguire un particolare compito. Può trovarsi in diverse configurazioni caratterizzate da una variabile che appartiene ad un determinato insieme di stati, e che evolve in base agli stimoli od ordini ricevuti in ingresso.

Automa Ibrido (AI)‏ Combina entrambi: Vantaggi Comportamenti continui (Equazioni Differentiali)‏ Transizioni discrete Vantaggi Semplicità Abilità di rappresentare e descrivere i sistemi In informatica teorica e in matematica discreta, un automa è un dispositivo, o un suo modello in forma di macchina sequenziale, creato per eseguire un particolare compito, che può trovarsi in diverse configurazioni più o meno complesse caratterizzate primariamente da una variabile che appartiene ad un determinato insieme di stati, e che evolve in base agli stimoli od ordini ricevuti in ingresso schematizzati da simboli appartenenti ad un determinato alfabeto. Quando l'automa si trova in un dato stato, esso può accettare solo un sottoinsieme dei simboli del suo alfabeto. L'evoluzione di un automa parte da un particolare stato detto stato iniziale. Un sottoinsieme privilegiato dei suoi stati è detto insieme degli stati finali o marcati. Si definisce anche come un sistema dinamico (Teoria dei sistemi) (si evolve nel tempo), discreto (nella scansione del tempo e nella descrizione del suo stato) e invariante (il sistema si comporta alla stessa maniera indipendentemente dall'istante di tempo in cui agisce). In genere gli automi sono deterministici, ovvero dato uno stato ed un simbolo in ingresso è possibile una sola transizione.

Esempio di Automa Ibrido Un HA consiste di: Variabili Grafo di controllo che ha degli stati (chiamati modes) e interuttori chiamati switches Predicati init, inv, flow per ciascun mode Condizioni di salto and Eventi per ciascuno switch. Un semplice termostato come esempio: [x>21] Off x = - 0.1x [x ≥ 18] On x = 5 - 0.1x [x ≤ 22] [x=20] [x<19]

Potenziale di azione (AP)‏ (HyperPhysics, Georgia State University)‏

Modello per il nostro Automa Ibrido Stimulated

Quali sono gli obiettivi Migliorare l’efficenza computazionale: Rendere possibile simulazioni su larga scala Analisi formale (lavori in corso): Safety Liveness Safety: SE il programma termina, allora il suo risultato è corretto. (N. B. il programma potrebbe non terminare e non dare nessun risultato)‏ Liveness: il programma termina e il suo risultato è corretto. In altri termini: la proprietà di liveness esprime il fatto che se qualcosa deve accadere, allora effettivamente accadrà (eventually, prima o poi).

Alcune assunzioni Ogni mode corrisponde ad una configurazione open/closed dei gates. I gates di sodio e potassio (conduttanze) sono mutualmente independenti uno dall’altro. Il comportamento del Gate (conduttanza) all’interno di un mode è dato da una equazione differenziale lineare.

Automa Ibrido per HH

Simulazione per modello HH

AI per NNR model

Simulazione per modello NNR Single cell, single AP 3 APs on a 2*2 cell array

Simulazione Spaziale su larga scale per modello NNR Tessuto di 400*400 cellule

Performance Su Pentium® 4 CPU 3.00GHz, 1G memoria

CellExcite

Diffusion Model

Esempio 1: Semplice Stimolo mV -80 -66 -52 -38 Continuous Behaviour -24 -10 4 18 32 46 60 1 ms 50 ms 100 ms Discrete Behaviour Stimulated State Upstroke State Resting State Plateau State 1 ms 50 ms 100 ms

Esempio 2: Fibrillazione Ventricolare mV -80 -66 -52 -38 -24 -10 1 ms 50 ms 100 ms 4 18 32 46 60

Esempio 3: Defibrillazione mV -80 -66 -52 -38 -24 -10 4 18 32 46 60

Conclusioni L’eccitazione della cellula può essere modella con sistemi ordinari di equazioni differenziali: Hodgkin-Huxley Luo-Rudy Neo-Natal Rat L’approccio dell’automa ibrido combina: Equazioni Differentiali Transizioni discrete Simulazione utilizzando gli Hybrid automata Accurata Efficiente Facile da estendere ad altri sistemi biologici complessi

Grazie per l'attenzione