Le cellule ciliate Dr. Paola Perin Dipartimento di Scienze Fisiologiche-Farmacologiche Cellulari-Molecolari – Università di Pavia Good morning. Those of you that know Dr. Masetto will have noticed I’m not him. I am Dr. Perin, and I have been working together with Dr. Masetto for a while, so I am going to speak on his behalf. We are going back to the semicircular canal, which is the preparation we have focused on in the past years. The problem we are trying to give an answer to is how do functional properties of canal hair cells develop during embryonal life, and in particular how does the electrical response of canal hair cells change during that time. In the past years, our lab and others have built a map of these properties in the adult animals, showing that hair cells from different regions of the sensory epithelia express different combinations of ion channels.

Localizzazione delle cellule ciliate Sistema vestibolare Sistema della linea laterale Sistema acustico Pochi recettori (20000 cellule vestibolari, 16000 cellule acustiche per orecchio) Canali semicircolari Labirinto membranoso Linea laterale Organi otolitici Coclea

L’orecchio interno Aprendo il labirinto osseo si trova all’interno il labirinto membranoso che contiene gli organi sensoriali Tra il labirinto osseo e membranoso: spazio perilinfatico Le cellule ciliate sono localizzate in zone specializzate del labirinto

Epiteli sensoriali Coclea Ampolle Cupola Otolito Sacculo Canali semicircolari Utricolo Creste ampollari nei tre canali semicircolari (verticale anteriore, verticale posteriore, orizzontale); Macule negli organi otolitici (sacculo e utricolo); Organo di Corti nella coclea Annessi acellulari: Cupola (canali) Membrana e massa otolitica (utricolo e sacculo) Membrana tettoria (coclea) Membrana tettoria

Struttura degli epiteli sensoriali Polo apicale (endolinfatico) Polo basolaterale (perilinfatico) Epitelio monostratificato Cellule ciliate (meccanocettori) Cellule di supporto (producono annessi acellulari, altre funzioni glia-simile)

Fluidi labirintini Il labirinto e’ bagnato da due fluidi diversi: Perilinfa (nello spazio perilinfatico, in giallo): alto Na, basso K Endolinfa (all’interno del labirinto membranoso, in azzurro): alto K, basso Na, bassissimo Ca L’endolinfa viene continuamente prodotta dall’azione delle cellule della stria vascolare (coclea) o dalle dark cells (vestibolo) e riassorbita dal sacco endolinfatico all’interno del cranio Sacco endolinfatico timpano

L’apparato di meccanotrasduzione Regione apicale: ciuffo di stereociglia Movimenti delle stereociglia generano la corrente di recettore meccanosensibile (corrente MET) Regione basolaterale: canali ionici voltaggio-dipendenti, sinapsi Cellula compatta, senza divisioni nette tra regioni Feedback elettromeccanico

L’apparato apicale chinociglio IHC OHC Sacculo di rana Coclea di topo

Struttura dell’apparato apicale In un ciuffo ciliare, le stereocilia sono disposte a canne d’organo con altezza decrescente a partire dal chinociglio (dove esiste) Le stereociglia sono collegate tra loro da varie classi di filamenti I tip links collegano stereociglia di file adiacenti Direzione di collegamento dei tip links

Molle di gating I tip links fungono da molle che trasmettono l’energia meccanica di flessione delle stereocilia ai canali di meccanotrasduzione Le altre classi di legami tra stereociglia non sono accoppiate con I canali MET L’apparato meccanosensibile risponde soltanto a movimenti in una direzione La distruzione o assenza dei tip links elimina la meccanosensitivita’ delle cellule ciliate

Biofisica della meccanotrasduzione I tip link sono continuamente in tensione per contrastare la rigidita’ delle radicole di actina Due molle in opposizione: Kx(link)=K’x’(actin) X’ = distanza di separazione delle stereociglia dopo rottura dei tip link X=hd H: proiezione sul piano di X’ D: allungamento della molla di gating Valori misurati: X’=130 nm K’=200 mN/m X= 7 nm Tip link Radicole di actina

Biofisica della meccanotrasduzione Il gating e’ una modificazione conformazionale di un canale ionico Cosa succede se un canale meccanosensibile si deforma? Deformazione stimata: 4 nm Canali aperti Effetto ”tiro alla fune” della complianza di gating Posizione di riposo Canali chiusi

Biofisica della meccanotrasduzione Per aprire un canale ionico bisogna fornire energia Energia interna stato chiuso: Ec Energia interna stato aperto: Eo Probabilita’ di apertura del canale PO: Per un canale MET l’energia e’ fornita dal movimento del tip link:

Biofisica della meccanotrasduzione Il ciuffo di ciglia viene mosso da una forza esterna Lo stiramento dei tip links dipende dalla forza applicata e dalla rigidita’ del ciuffo di stereociglia (forza elastica: F=kx) La rigidita’ diminuisce con l’apertura dei canali MET Feedback meccanico positivo attorno alla posizione di apertura dei canali MET Amplificazione del segnale meccanico (altalena)

Biofisica della meccanotrasduzione In assenza di altri meccanismi, l’apparato di meccanotrasduzione a riposo potrebbe oscillare oppure stabilirsi in uno dei due punti di flesso Il meccanismo di amplificazione meccanica si ha solo attorno al punto di zero Come fa il sistema a rimanere al punto di zero?

Adattamento della meccanotrasduzione In presenza di stimolazione meccanica prolungata il punto di zero del sistema si sposta La forza necessaria per mantenere il sistema in una data posizione non e’ costante ma varia con lo stato di apertura dei canali

Adattamento della corrente MET Stimolo: flessione costante del ciuffo di ciglia La corrente MET si attiva inizialmente e poi inattiva Dopo lo stimolo, la posizione di riposo iniziale non e’ piu’ il punto di zero L’apparato meccanotrasduttore non cambia la sua sensibilita’, ma il suo punto di zero si sposta! Cambia la distanza tra I due capi del tip link

Adattamento della corrente MET In presenza di adattamento, servono stimoli meccanici piu’ forti (spostamenti piu’ lunghi) per evocare la stessa risposta ma la risposta massimale non cambia

Meccanismi di adattamento 2 meccanismi con scale temporali diverse (1-10 ms, 10-100 ms) Entrambi dovuti al Ca2+ entrato attraverso il canale MET Adattamento rapido: effetto diretto sul canale (inibizione Ca-dipendente) Adattamento lento: attivazione di un motore actomiosinico (miosina-1c)

Amplificazione e sintonizzazione L’interazione tra la gating compliance del canale MET e il movimento attivo dovuto all’adattamento produce oscillazioni meccaniche del ciuffo di ciglia Variando la quantita’ e la natura dei meccanismi di tamponamento ed eliminazione del Ca2+ nelle stereociglia si varia la frequenza delle oscillazioni Ciascuna cellula cigliata e’ meccanicamente sintonizzata per rispondere al meglio ad una data frequenza

Natura molecolare dei tip links Identificati con la proteina caderina 23 (cdh23) Assenza di cdh23: problemi acusticovestibolari Anticorpi diretti verso cdh23 marcano I tip links Dimensioni di cdh23 = a quelle dei tip links Problema: L’apparato di meccanotrasduzione e’ elastico, mentre cdh23 e’ rigida

I canali di meccanotrasduzione Canali cationici nonselettivi Molto permeabili al Ca2+ Identificati con TRPA1 nei mammiferi Possibile contributo di TRPN1 nei vertebrati inferiori Entrambi I canali hanno domini di ancorina (17 per TRPA1 e 29 per TRPN1) Il canale e’ fissato alla membrana in modo elastico Domini di ancorina in un canale TRP

Regolazione del Ca2+ nelle stereociglia Proteine citoplasmatiche che legano il Ca2+ espresse in modo variabile Isoforme diverse di PMCA nelle stereociglia (PMCA2) e nel soma (PMCA1)

La corrente di meccanotrasduzione I canali MET sono nonselettivi Composizione dell’endolinfa simile al citoplasma: 100 mM K 20 mM Na 100 mM Ca Il potenziale di membrana delle cellule ciliate e’ negativo La corrente e’ quasi completamente portata dal K ma e’ depolarizzante Il Ca2+ entra per gradiente di concentrazione

Il potenziale di recettore La corrente MET depolarizza la cellula (Vz variabili tra -80 mV e -40 mV) La depolarizzazione apre i canali del Ca2+ presinaptici La cellula rilascia neurotrasmettitore La fibra afferente si attiva La chiusura e l’adattamento dei canali MET e l’attivazione di canali ionici basolaterali ripolarizzano la cellula ciliata, arrestando il rilascio del neurotrasmettitore.

Eterogeneita’ nelle cellule ciliate Tutte le cellule ciliate possiedono un apparato ciliare Le componenti della meccanotrasduzione appaiono simili in tutte le cellule ciliate La sensibilita’ dell’apparato ciliare varia: Diversa geometria (lunghezza, spaziatura stereociglia) Diverso numero di canali MET Diverse proprieta’ dei canali MET Diverso metabolismo del Ca2+ Variazioni molto piu’ radicali nel polo sinaptico: Correnti ioniche Metabolismo del Ca2+ Numero e tipo di sinapsi

Il potenziale di recettore Il potenziale di riposo delle cellule ciliate e’ compreso tra -80 e -40 mV Le correnti di Ca2+ voltaggio-dipendenti presinaptiche si attivano a -60 mV e hanno il picco a -20 mV Potenziali di recettore utili per la trasmissione del segnale alla sinapsi afferente saranno compresi tra -60 e -20 mV

Scarica afferente vestibolare Attività a riposo Attività evocata La scarica a riposo delle fibre afferenti è dovuta al rilascio di glutamato dalla cellula ciliata al suo potenziale di riposo (più positivo della soglia di attivazione delle correnti di Ca)

Il potenziale di recettore Al SNC Glutamato provoca l’apertura dei canali del Ca2+ presinaptici e il rilascio di glutamato al terminale afferente attiva canali del K+ che ripolarizzano la cellula In alcuni casi attiva canali del Na+

Risonanza elettrica Nei vertebrati inferiori, il potenziale di membrana delle cellule ciliate acustiche oscilla spontaneamente La frequenza di oscillazione elettrica varia insieme a quella meccanica dell’apparato ciliare I due meccanismi producono una precisa sintonizzazione di ciascuna cellula ad una data frequenza

Risonanza elettrica La risonanza e’ dovuta alla interazione tra canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti e canali del K+ Ca-dipendenti Le proprieta’ dei canali delle cellule ciliate acustiche sono distribuite in maniera tonotopica lungo la coclea Cellule a f0 piu’ alta hanno correnti di Ca piu’ ampie e canali BK piu’ veloci 7 siti di splicing alternativo per I canali BK

Risonanza elettrica Nei mammiferi la risonanza elettrica non e’ stata osservata – meccanismo attivo addizionale dovuto alla elettromotilita’ delle OHC Nel sistema vestibolare la sintonizzazione ad una data frequenza non serve Non e’ chiaro se I feedback meccanici funzionino in modo simile che nel sistema acustico E’ possibile che le correnti ioniche delle cellule vestibolari servano a smorzare la risonanza meccanica dell’apparato meccanosensibile

Risonanza e cellule vestibolari Le cellule vestibolari esprimono una grande varieta’ di correnti di K La corrente IA potrebbe essere implicata nello smorzamento delle oscillazioni nella corrente MET generate dai feedback negativi Le correnti delayed rectifier potrebbero regolare il guadagno della cellula

Cellule di tipo I e di tipo II Nel sistema vestibolare degli amnioti si trovano le cellule di tipo I, caratterizzate da una sinapsi a calice Le cellule di tipo II si osservano in tutti I vertebrati