Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento Accoppiamento dipolare

Accoppiamento dipolare A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che sono vicino nello spazio

Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A

Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore

Distance constraints mJ B0 mI q r NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling mJ B0 mI q r

Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND) E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendenti Porta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE) E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loro Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

Through space AND throuhg bonds Through bond

1D experiment ..Too crowded.. Chemical shifts relaxation rates Could be nice but... Not enough to get a structure What do we learn?

The need for multidimensional NMR

The need for multidimensional NMR

Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulsi il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta

A 2D! An FID is a series of data points, each data point being separated by a sampling time (dwell time) F(t) A computer will consider an FID as a one dimensional array of data points.Each point has a different intensity 0, d,2 d,3 d,4 d …….…n d 3m 3m+d 3m+2 d 3m 3m+3d F(t2) F(t) 3m+ d 3m+2 d We will now repeat the experiment a second time, just changing another delay previous to acquisition. F(t1) We collect a second F(t) which will be identical but for such delay. We store it in this way. We repeat the same experiment n times We obtain a two dimensional array of data points in which rows and columns represent INDEPENDENT TIME DOMAINS. EACH POINT will be a function of both t1 and t2 The overall signal is an F(t1,t2) 3m+n d

Fourier transformation F(t1,t2) Fourier transformation (t2) F(n1,t2) Fourier transformation (t1) F(t1,n2) F(n1,n2)

Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Io ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà la informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (wI t1) (wSt2)

EXAMPLE O H H N C C We make a 1H experiment and we acquire. I observe Hn Then all signals transfer the information because of scalar coupling H H N C Spectrum before The J coupling Then I observe Hc I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm H H N C Spectrum before This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling H H N C This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C If you begin from Hc , the situation is the same ! Spectrum before The J coupling Hc Hc Hn J-coupling Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C Therefore, if I consider only this system Hc Hc Hn Spectrum before The J coupling Hn J-coupling Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

The second dimension = t2 The first dimension = t1 The second dimension = t2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

Usually t1 is also defined as indirect dimension t2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies Definitions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions F1 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions F2 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

Accoppiamento scalare L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

COrrelation SpectroscopY Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ H4-H5 COSY= COrrelation SpectroscopY

COrrelation SpectroscopY Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ 2 4 3 H4-H5 5 6 COSY= COrrelation SpectroscopY 1

Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

The “old times” approach NOESY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) COSY NOESY conn. COSY conn

Through space AND throuhg bonds Through bond

Troppi segnali 1H ?

Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H 15N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY

Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H protein size >20000 15N and 13C Scalar couplings through 13C atoms -triple resonance -assignment -structure

1J couplings for backbone resonances

The HSQC experiment

Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings

Heteronuclear NMR OBSERVE 13C during t1 Transfer the information to all 1H coupled Observe 1H during t2 No more diagonal Each peak indicate A differen H-C pair 13C 1H

Heteronuclear NMR OBSERVE 13C during t1 Transfer the information to all 1H coupled Observe 1H during t2 No more diagonal CH2 Two protons are bound to the same carbon 13C 1H

The HSQC experiment

The HSQC experiment Detect H-N couplings Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak if you can do the job (whatever is your job)

STRUTTURE IN SOLUZIONE VIA NMR

Solution structure of oxidized and reduced Cytochrome c Cyt c oxidized Cyt c reduced Banci, Bertini, Bren, Gray, Sompornpisut, Turano, Biochemistry, 1997 Baistrocchi, Banci, Bertini, Turano, Bren, Gray, Biochemistry, 1996

Active site channel of Reduced Monomeric Q133 Copper Zinc Superoxide dismutase  Reduced Q133M2SOD  Oxidized human SOD

Structure of Ce3+ substituted Calbindin D9k 20 40 60 80 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Paramagnetic structure Diamagnetic structure RMSD backbone Residue Number risultato Bertini, Donaire, Jiménez, Luchinat, Parigi, Piccioli, Poggi, J.Biomol. NMR, 2001,21,85-98

The HSQC experiment Detect H-N couplings Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak if you can do the job (whatever is your job)

Screening in silico + NMR Identificazioni dei siti di interazione: Analisi delle superfici in silico Analisi delle superfici via NMR (HSQC)

15N HSQC del CytC con Cloroamina T ppm ppm

The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding Apo Cb @ 3.3 M GdmCl Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl Ca2+ Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding

Structure-Activity Relationship by NMR

Dall’analisi risultano interagire 12 composti Screening via NMR Libreria di ProtEra 14 serie da 26 composti Proteina standard CytC da lievito Via Water LOGSY è stata analizzata l’interazione del CytC con 3 serie di composti (78) Dall’analisi risultano interagire 12 composti NMR time per inibitore: 45’x 2 Conc. del CytC non marcato: 8 mM Conc. dell’inibitore: 800 mM

Water LOGSY del CytC con Cloroamina T 700MHz 303K