Coltivazione dei virus animali in vitro: colture cellulari in vivo: sistemi animali

Colture cellulari coltivazione del virus su larga scala rappresentano il metodo di elezione per la coltivazione dei virus animali coltivazione del virus su larga scala condizioni chimico-fisiche standard infezione sincrona

Colture cellulari Condizioni chimiche Condizioni fisiche condizioni chimico-fisiche Condizioni chimiche terreno di coltura chimicamente definito: soluzione isotonica di sali, glucosio, vitamine, aminoacidi, pH 7.3 (H2CO3/CO2), addizionato con siero per fornire fattori di crescita. Condizioni fisiche - temperatura di 37°C

COLTIVAZIONE DI VIRUS SU LINEE CELLULARI - Linee di cellule primarie 5-10 cicli di subcoltivazione - Linee di cellule diploidi da tessuto embrionale cicli di 40-50 generazioni - Linee cellulari permanenti* crescono in monostrato o in sospensione producono tumori solidi negli animali * - Trasformazione spontanea - Trasformazione con virus oncogeni - Linee tumorali Non utilizzabili per produrre vaccini

Colture cellulari crescono su superfici solide (plastica, vetro). Cellule in monostrato crescono su superfici solide (plastica, vetro). Sono le più usate in virologia. Cellule in sospensione

Colture cellulari Tripsina/EDTA La maggior parte delle cellule in coltura replica ogni 24-48 ore e deve essere sub-coltivata ogni 3-4 giorni. Le cellule in sospensione sono diluite in nuovo terreno di coltura Le cellule in monostrato devono essere rimosse dalle superfici di crescita con enzimi proteolitici (tripsina) e sostanze chelanti ( EDTA). Tripsina/EDTA

Cappa a flusso laminare biohazard sterilità sicurezza

o un fattore essenziale per l’espressione del genoma INFEZIONI VIRALI Sospensione virale 1 h a 37°C cellule permissive Produzione di virus infettante cellule non permissive mancano di un fattore necessario per la crescita del virus cellule resistenti C.P.E. non hanno recettori o un fattore essenziale per l’espressione del genoma

Animali da laboratorio Storicamente il primo metodo per studiare la propagazione dei virus. Svantaggi - 1) costoso, 2) non omogeneo, 3) porta alla generazione di mutanti virali, 4) problemi etici, Vantaggi - 1) fornisce informazioni sui meccanismi patogenetici del virus, 2) alcuni virus possono essere studiati solo in vivo,

UOVO EMBRIONATO

Titolazione virale La quantità del virus è detta titolo (il titolo virale può cambiare a seconda del metodo usato) Il titolo è la misura della concentrazione del virus e viene espressa in unità/ml Può essere rilevata mediate vari saggi - saggio delle placche, saggio di formazione di foci di trasformazione, saggio di diluizione limite, saggio di emoagglutinazione .

Misurazione diretta del numero di virioni Microscopia Elettronica La sospensione virale è posta su un retino per ME e colorato. L’inclusione di una quantità conosciuta di sfere di latex permette la quantizzazione del virus sfere di latex poxvirus (a forma di mattone e leggermente più piccoli)

Particelle virali vs. virioni infettanti Non tutte le particelle virali sono infettanti. In molti casi la maggior parte dei virioni non è infettante il rappoto tra il n° totale di particelle virali e i virioni infettanti è definito come rapporto particelle/PFU From Principles of Virology , Flint et al ASM press

CICLO UNICO di REPLICAZIONE “One-Step” growth VIRUS Amount of virus inoculated Time BATTERI Number of viable bacteria inoculated Time Replication in progress Latency Production of infective virus Lag phase Exponential growth

CURVA DI CRESCITA Intracellular virus Latent period 1.000 Intracellular virus 100 Virus Release Latent period Assembly Virus Eclipse period Extracellular virus Infectious virus/cell 10 Yield per cell Early phase Genome replication Late phase 1 Time (hours) p.i. 0 2 5 8 10 16 20 30

-Penetrazione - Tutti i virus devono attraversare il doppio strato lipidico (i virus delle piante e dei batteri devono attraversare anche la parete cellulare). La presenza o l’assenza dell’ involucro virale determina una notevole differenza nel meccanismo di penetrazione

- Adsorbimento virale - primo evento del ciclo di replicazione virale Riconoscimento della cellula target da parte di proteine virali (VAP) VAP = Virus Attachment Proteins interazione elettrostatica - seguita da interazione idrofobica localizzata - limita l’infezione a specifici tipi di cellule (cellule permissive) determina il tropismo del virus Tropismo tissutale - es.: rosolia (cellule epidermiche) . morbillo (ghiandole salivari) Tropismo di specie - es.:. influenza (cellule di mammifero e di uccelli), poliovirus (cellule di primati)

VAP Famiglia Virus VAP Picornaviridae Rhinovirus VP1 regione di adesione VAP Famiglia Virus VAP Picornaviridae Rhinovirus VP1 Reoviridae Rotavirus VP7 Rhabdoviridae VSV G protein Orthomyxoviridae Influenza A HA Paramyxoviridae Sendai HN Retroviridae HIV gp120 Adenoviridae Adenovirus Fiber protein Herpesviridae HSV gC - gD (HA di Orthomyxovirus)

Recettori di VIRUS ANIMALI Virus Recettore tipo molecolare funzione Influenza virus acido sialico carboidrato Usato anche da Reo- e corona- virus Virus del Morbillo CD46 e SLAM proteina di superficie Usato anche da dei linfociti B e T HHV6 Poliovirus Pvr proteina simile a Ig Rhinovirus ICAM-1 proteina simile a Ig adesione intercellulare Virus della Rabbia recettore per proteina neuronale acetilcolina

ENDOCITOSI Semliki Forest virus (SFV), un togavirus rappresenta il primo esempio di penetrazione per endocitosi Studi di microscopia elettronica (1980) dimostravano che il virus penetra mediante vescicole - oggi note come vescicole ricoperte di clatrina o CCV) A. Helenius

Endosomi e virus Gli endosomi sono utilizzati dalla cellula per l’assunzione di nutrienti e fattori di crescita Una caratteristica degli endosomi è la loro progressiva acidificazione - dovuta all’azione di H+/ATPasi vacuolari I virus utilizzano questo meccanismo cellulare per: penetrazione spoliazione per i virus gli endosomi inoltre assicurano: trasporto citosolico mediante il sistema dei microfilamenti e dei microtubuli specifico ambiente ionico e stato redox lipidi per la fusione (penetrazione) From Cell Biology, Pollard and Earnshaw, Saunders

in alcuni casi sono richieste interazioni con più proteine Adsorbimento e penetrazione di Adenovirus corecettore

Penetrazione di Adenovirus entrata mediante endocitosi clatrina-dipendente l’abbassamento del pH determina la perdita delle fibre e lisi della membrana degli endosomi da parte della preteine della base dei pentoni From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press

Reovirus Raro esempio di virus che richiede la fusione degli endosomi con i lisosomi I Reovirus hanno un doppio capside, stabile a pH bassi (virus gastro-intestinali; rotavirus) Le proteasi lisosomiali degradano il capside esterno - formazione della particella subvirale Le fasi successive del processo di penetrazione non sono ancora del tutto conosciute From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press

Picornaviridae penetrano per endocitosi in maniera pH indipendente l’interazione con il recettore determina cambi conformazionali nella struttura del virione - perdita della VP4 e formazione della particella A (meno densa e più rilassata) From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press

Le particelle A sono idrofobiche e possono formare un poro sulla membrana endosomiale o citoplasmatica della cellula ospite. From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press

Meccanismi di penetrazione: FUSIONE 1) Fusione sulla plasmamembrana (pH-indipendente) 2) Fusione negli endosomi (pH-dipendente) 1 2

PARAMYXOVIRIDAE Struttura dei virioni PARAMYXOVIRUS

Meccanismo di Fusione dei Paramyxovirus

due recettori sono meglio di uno PENETRAZIONE VIRALE due recettori sono meglio di uno Glicoproteina gp120 adsorbimento Glicoproteina gp41 entrata HIV Recettore = CD4 (linfociti T) + Co-recettori = CXCR4 o CCR5 (recettori di chemiochine) * Fusina usata come recettore da alcuni isolati di HIV-2

MECCANISMO DI FUSIONE DI HIV In seguito al riconoscimento del recettore CD4, avviene un cambio conformazionale nella proteina gp120 che causa l’esposizione di un peptide fusogeno presente nella proteina gp41. From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press gp120 di HIV riconosce il recettore CD4 e il co-recettore (CCR5 o CXCR4)

Penetrazione di Herpesvirus Riconoscimento dei recettori eparansolfato da parte della gC. Successivo adsorbimento della glicoproteina gD ad un co-recettore specifico Molecole co-recettoriali HveA TNF-R HveB Nectin2 HveC Nectin1 HveD PVR Fusione dell’involucro virale con la plasmamembrana mediato da gB in associazione con il complesso gH-gL. Penetrazione del nucleocapside virale

FUSIONE pH-DIPENDENTE Virus influenzale FUSIONE SULLA MEMBRANA ENDOSOMIALE

Il cambio di pH nell’endosoma ha un ruolo importante per la fusione del virus influenzale. Infatti, il virus presenta sul suo involucro la proteina M2 che a pH acido forma un canale ionico che permette l’acidificazione del virione, e promuove cambi conformazionali della proteina HA ed il distacco di M1 dai complessi M1/RNP Sostanze che bloccano la proteina M2 inibiscono la penetrazione del virus influenzale - amantadina (altamente specifica per i canali ionici M2 virali, non ha effetto sui canali cellulari H+/ATPasi)

Fusione del virus influenzale Cambio conformazionale di HA estensione peptide fusogeno pH acido c. Struttura del dominio solubile di HA2 a pH acido b. Struttura del dominio solubile di HA2 a pH neutro pH neutro Rotazione C-D 180 Virus a. Monomero HA0 (550 aa) in presenza di proteasi = subunita’ HA1 (VAP) + HA2 (Fusione), legate da legami S-S. N-term di HA2 = peptide fusogeno (20 aa) Box A-C-D = a-eliche

(ecc. Retrovirus e virus influenzali) virus a RNA (ecc. Retrovirus e virus influenzali) virus a DNA (ecc. Poxvirus) citoplasma nucleo

REPLICAZIONE DEI VIRUS a DNA Tutti i virus eucariotici a DNA replicano nel nucleo eccezione: poxvirus VANTAGGI utilizzo di enzimi cellulari per la trascrizione degli mRNA virali RNA polimerasi II Attivatori e co-attivatori trascrizionali Enzimi per la sintesi del cap e per il processamento (splicing) dei trascritti utilizzo di enzimi cellulari per la replicazione del genoma DNA polimerasi ed enzimi associati (girasi, ATPasi, elicasi, primasi, RNasi, enzimi di riparo, ligasi)

Il trasporto citoplasmatico Adenovirus Herpesvirus I capsidi (o nucleocapsidi) si legano al citoscheletro e utilizzano proteine dinamiche associate ai microtubuli (i.e. dineina) per facilitare il loro trasporto intracellulare

Importo nucleare Il nucleo della cellula è circondato da un doppio strato lipidico - la membrana nucleare. un’ulteriore barriera per il processo di infezione La membrana nucleare è fornita di canali di trasporto - i pori nucleari From Flint et al Principles of Virology ASM Press

Penetrazione nel nucleo Trasporto del capside virale fino ai pori nucleari grazie alla presenza di sequenze NLS in proteine capsidiche Parvovirus penetrazione diretta del virus Adenovirus legame del capside al poro nucleare “uncoating” finale del capside il DNA è “iniettato” nel nucleoplasma capsidi vuoti di Virus Herpes Simplex ai pori nucleari

Parvovirus Esempio di entrata diretta nel nucleo Piccolo virus a ssDNA a simmetria icosaedrica (diametro 18-26 nm) Penetrazione mediata endocitosi pH-dipendente Il capside è formato da VP1, VP2 e VP3 VP1 contiene una sequenza di segnale di localizzazione nucleare (NLS) La sequenza NLS si lega a recettori dei PORI NUCLEARI (carioferine o importine) che permettono l’entrata diretta del virus nel nucleo dove avviene la spoliazione

Uncoating di Adenovirus Trasporto mediato da dineina Presenza di sequenze NLS in proteine del capside (100 nm) I capsidi vengono trasportati fino ai pori. ma………la massima grandezza funzionale del poro nucleare è di 26 nm Il capside si lega al poro nucleare, subisce il disassemblaggio finale e il DNA viene “iniettato” nel nucleo. From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press

Herpesvirus presenza di sequenze NLS nelle proteine che formano il capside il capside virale viene trasportato ai pori nucleari si lega al poro nucleare e subisce “uncoating” finale il DNA è “iniettato” nel nucleoplasma. Notare i capsidi vuoti ai pori nucleari From Whittaker Trends Microbiol 6: 178

Uncoating di Virus Influenzale L’evento chiave per la spoliazione dei genomi del virus influenzale è la dissociazione pH-dipendente tra la proteina di matrice M1 ed i complessi RNP. - I complessi RNP sono sufficientemente piccoli per traslocare attraverso i pori nucleari. - La nucleoproteina (NP) contiene sequenze NLS From Whittaker Exp. Rev. Mol. Med. 8 February, http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/01002447h.htm