APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE ESERCITAZIONI 2009 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE Quantizzazione delle proteine Applicazioni delle proteine di fusione

1. Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)

Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford Il colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a 595 nm La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. Quantità di proteina N.B. Il saggio è indipendente dal tipo di proteina

Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford VANTAGGI Semplicità di preparazione del reattivo Sviluppo del colore immediato Stabilità del complesso Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml) Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,degli agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azide SVANTAGGI Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di uno standard Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida

Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE Saggi di Doppio Ibrido c Saggi di Pull-Down Proteina di fusione Proteina Tag Saggi di legame Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina

Estratto proteico cellulare 1. Pull-Down Proteina di fusione Estratto proteico cellulare J Z ESCA W Proteina A X Proteina A Tag Y Proteina B ESCA ? PREDA Proteina B PREDA

Pull-Down Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina) Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina Glutatione) Controllare su gel di poliacrilammide la qualità della purificazione Preparare gli estratti cellulari eucariotici che contengono la proteina d’interesse

Pull-Down ESPERIMENTO CONTROLLO Esca Resina GST Resina GST Preda X J Y Z X Y Preda J Z Estratto cellulare Estratto cellulare lavaggi lavaggi X Preda GST Esca Resina Preda GST Resina Z

Pull-Down Verifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot TRASFERIMENTO WESTERN BLOT WESTERN BLOT BLOCKING ANTICORPO PRIMARIO ANTICORPO SECONDARIO SVILUPPO

Pull-Down: Verifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot GST Resina X Preda Y J Z Preda GST Esca Resina MK INPUT CO ESP La nostra proteina d’interesse è stata legata dalla proteina di fusione! Il controllo è pulito

Pull-Down LIMITI DEL SAGGIO: Necessità di controlli negativi, presenza di legami aspecifici alla resina. Interazioni deboli o transienti potrebbero non essere rilevate. La presenza del tag potrebbe interferire con il legame. E’ un sistema forzato che potrebbe non rispecchiare l’effettiva situazione biologica.

Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE Saggi di Doppio Ibrido Saggi di Pull-Down Proteina di fusione Proteina Tag Saggi di legame Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina

2. Sistema del Doppio Ibrido Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere organizzati funzionalmente in domini distinti: Il dominio legante il DNA (DBD) Il dominio di transattivazione (AD) AD DBD

Sistema del Doppio Ibrido I domini proteici sono normalmente identificati a classificati in base alle loro caratteristiche strutturali, funzionali e legate all’evoluzione. Un dominio può quindi essere descritto come un’unità strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata durante l’evoluzione e in grado di funzionare indipendentemente dal contesto a cui appartiene la proteina.

Sistema del Doppio Ibrido Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo che riacquistino la loro funzionalità “ri-incontrandosi”. AD DB AD DB AD AD DB DB

Sistema del Doppio Ibrido Tra i fattori di trascrizione più utilizzati c’è GAL4, che legando il promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si colorano di blu. Gal4 AD DB β-galattosidasi X-Gal UAS Lacz

Sistema del Doppio Ibrido Creazione di due ibridi PREDA Proteina A ESCA DBD AD Proteina B Proteina A DBD Promotore Gene reporter Promotore Gene reporter Se le due proteine di interesse interagiscono, il gene reporter sarà trascritto AD Proteina B Proteina A DBD Promotore Gene reporter

Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE Saggi di Doppio Ibrido Saggi di Pull-Down Proteina di fusione Proteina Tag Saggi di legame Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina

3. Peptide Microarray Tecnica “high-throughput” che permette di ottenere risultati su larga scala in un tempo limitato. E’ utilizzata per studiare le interazioni tra il dominio di una proteina di interesse e il peptide di un’altra proteina. Per esempio: il dominio PTP delle proteine fosfatasi riconosce brevi peptidi fosforilati esposti sulle proteine substrato e li defosforila FOSFATASI Dominio PTP P Y

Peptide Microarray Migliaia di peptidi vengono stampati su un supporto di silice (microarray) che viene incubato con il dominio proteico di interesse. L’interazione dominio-peptide viene rivelata attraverso l’utilizzo di un anticorpo coniugato a un fluoroforo

Peptide Microarray P Stampare su supporto di silice i peptidi di interesse. Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina) Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina Glutatione) Controllare su gel di poliacrilammide la qualità della purificazione Incubare il microarray di peptidi con la proteina di fusione Incubare il microarray con l’anticorpo coniugato al fluoroforo (ex. Anti-GST) Misurare l’intensità di fluorescenza che sarà proporzionale alla quantità di proteina che ha legato il peptide. P GST SHP2 P GST SHP2

Peptide Microarray Risultato tipico di un esperimento di “peptide microarray” PEPTIDE High signal intensity Low signal intensity ALTA INTENSITA’ LEGAME FORTE BASSA INTENSITA’ LEGAME DEBOLE

Validazione “in vivo” Topo Cellule di mammifera Drosophila Melanogaster Zebrafish