Absolute quantification of human brain metabolites using QUEST Alma Mater Studiorum - University of Bologna Centro di ricerca e diagnostica molecolare in vivo www.cermiv.unibo.it CeRMiV Absolute quantification of human brain metabolites using QUEST E. Malucelli1, D.N. Manners1, C. Testa1, C. Tonon1, R. Lodi1, B. Barbiroli1, S. Iotti1 1Dipartimento di Medicina Interna dell’Invecchiamento e delle Malattie Nefrologiche, University of Bologna, Bologna, Italy,

Magnetic Resonance Imaging (MRI) MRI Struttutale Diffusion Tensor Imaging (DTI) Trattografia Functional MRI (fMRI)

Introduzione Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante?

Introduzione Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante?

What is MRI used for? Perchè usare la MRI? Il segnale MRI deriva per la maggiro parte dai protoni dell’acqua Il corpo umano è largamente formato da acqua, specialmente i tessuti molli Il cervello umano è composto per il 78% di acqua

Perchè usare la MRI? Non invasiva Nessuna radiazione ionizzante Rilevamento di tessuti molli Alto contrasto e applicabilità Alta risoluzione spaziale CT MRI

MRI: Applicazioni cliniche A scopi clinici la MRI si utilizza per: Rilevare tumori e altre anormalità Rilevare regioni con ictus Rilevare emorragie celebrali Pianificare e guidare interventi E molto più……

MRI: Apllicazioni scientifiche MRI è utilizzata sia per scopi clinici sia per ricerca Studi funzionali cerebrali (functional MRI) Studi strutturali e morfologici cerebrali

MRI: dai protoni all’imamgine Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Magnetic: origine del segnale Resonance: eccitazione - rilevamento Imaging: convertire il segnale in immagine Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante?

MRI: dai protoni all’imamgine Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Magnetic: origine del segnale Resonance: eccitazione - rilevamento Imaging: convertire il segnale in immagine Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante?

MRI: dai protoni all’imamgine Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Magnetic: origine del segnale Resonance: eccitazione - rilevamento Imaging: convertire il segnale in immagine Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante? Il contrasto

super conducting magnet z gradient coil r.f. transmit/receive x gradient coil Why do we need a magnet and what are all these complicated coils inside? super conducting magnet subject gradient coils

MRI: dai protoni all’imamgine Orientazione casuale Magnete a superconduzione Gli spin sono polarizzati dal campo magnetico costante, B0 Magnetizzazione – M||B0 B0 M Boss fMRI

Coordinate del sistema z y x B0 La direzione del campo magnetico principale (B0) determina le coordinate del sistema Asse longitudinale: parallelo a B0 (asse z) Piano trasversale: perpendicolara a B0 (piano x,y) Dopo lo stimoli gli atomi tendono a ritornare alla posizione di equilibrio di M parallelo a B0

Solo la magnetizzazione trasversale riesce ha essere rilevata e a dare segnale Pulse-sequence diagram 90° RF Boss fMRI

Tempi di rilassamento: T1 e T2 Mxy time Mz Decadimento del segnale nel piano trasversale in accordo con il T2 Recupero della magnetizzazione lungo l`asse longitudinale in accordo con il T1 Impulso RF T1>T2 e-t/T2 1-e-t/T1

Tempo di eco (TE) e contrasto T2 Dopo l`eccitazione, il signale decade exponenzialmente in accordo con il T2. Ampiezza del segnale Tessuto1 (T2 lungo) Tessuto 2 (T2 corto ) TE

Echo Time (TE) e contrasto T2 Basso contrasto Segnale Alto signale TE corto TE

Echo Time (TE) e contrasto T2 Segnale Basso signal TE lungo Medio contrast TE

Echo Time (TE) e contrasto T2 Signal Alto contrasto Signale medio Medio TE TE

Repetition Time (TR) e contrasto T1 Contrast Mz (% of max) La magnetizzazione si riallinea con il campo principale in un tempo T1 Il T1 è diverso per ogni tessuto Ma... non si ha signale lungo Mz (solo sul piano Mxy) Tempo dall`impulso RF (ms)

Short TR Long TR T1 PD Short TE Long TE T2 Signal comes principally from water Depends on tissue properties Amount of water Physical and chemical structure Contrast comes from ‘relaxation’ processes

Ogni immagine possiede una rappresetazione nel corrispondente K spazio Spazio delel frequenze K Spazio Spazio immagine FT

Trasformata di Fourier K spazio acquisito Trasformata di Fourier

T1-Weighted Images Le sequenze per acquisire immagine pesate in T1 sono create e ottimizzate per creare immagini con contrasto tra sostanza grigia, bianca e liquor Tre fette assiali: Risoluzione spaziale di 1 mm3 Tempo d`acquisizione per l`intero cervello 10 minuti

Zoom In La sostanza grigia è ben definita Si può misurare lo spessore della corteccia e provare a correlare il dato con l`età e/o malattia o altri parametri Puntini e linee bianche: artefatti da flusso arterioso E` possibile acquisire a una maggiore risoluzione spaziele Con un lo svantaggio di aumentare il tempo di acquisizione

Tre fette di uno stesso volume Una singola acquisizione genera immagini rumorose L`immagine precedentemente mostrata era la media di 4 acquisizioni (per aumentare SNR) La MRI può essere 2D o 3D

Un`immagine di cattiva qualità Il soggetto ha mosso la testa durante l`acquisizione Artefatti di Ghosting and ringing Potrebbe essere utile solo per alcuni scopi clinici, ma non a scopi quantitativi di ricerca

Variazioni strutturali Le regioni celebrali mostrano diversi patterns di variazione volumetrica durante il corso della vita Questi effetti sono da attribuire principalmente alla diminuzione di densit’ sinaptica e poi alla morte cellulare

Diffusione dell`acqua La diffusione è un movimento casuale (moto Browniano) dovuta all`energia termica La diffusione è strettamente legata all`ambiente in cui si trovano le molecole d`acqua Einstein 1905, 5 articoli sul moto Brownian

Diffusione dell`acqua Nei tessuti la diffusività dell`acqua è condizionata dalla composizione dall`ambiente cellulare Se le membrane delle cellule sono disposte con direzionalità coerente la diffusione sarà anisotropica

MRI: Diffusione dell`acqua Fibre sostanza bianca Displacement of 4 particles starting at same origin Similar molecular displacements in all directions Greater molecular displacement along cylinders than across Isotropia Anisotropia

MRI: Diffusione dell`acqua Elissoide di diffusione Fibre sostanza bianca L`anisotropia può essere utilizzata per seguire i fasci di sostanza bianca

Tensore di diffusione Autovalore maggiore Autovettore maggiore:

Biomarkers micro-strutturali Mean diffusivity (MD=media{λi=1,3}) ≈ magnitudine diffusione Fractional anisotropy (FA=var{λi=1,3}/magn{D}) ≈ direzionalità FA = 0 diffusione isotropica (CSF) FA = 1 diffusione ad alta anisotropia (sostanza bianca) MD FA La sostanza bianca ha bassa MD ed alta FA La sostanza bianca compromezza strutturalmente ha alta MD e bassa FA

Mappe DTI FA colorata perla direzionalità delle fibre: x = Rosso y = Verde z = Blue Imamgine non pesata in diffusione Fractional Anisotropy

Mappa a colori dei principali fasci FA: Fractional Anisotropy; <D>: Mean Diffusivity

Field of Diffusion Tensor Ellipsoids Mappa a colori Field of Diffusion Tensor Ellipsoids Zoom sul corpo calloso che presenta un andamento delle fibre lungo l`asse X

Fiber tracking

Trattografia

Trattografia: Corpo Calloso

Fascio Corticospinale Trattografia: Fascio Corticospinale

Diffusione nell`Ictus La MD diminuisce nel tessuto cerebrale colpito da ictus dopo pochi minuti dal blocco del vaso sanguigno Il rigonfiamento che inizialmente subiscono le cellule causa una riduzione di spazio extra-cellulare, il quale possiede un alta MD rispetto all`ambiente intra-cellulare I danni causati dall`ictus non sono visibili dalla convenzionali immagini pesate in T1 o in T2 prima di 2-3 giorni dal blocco del vaso Le immagini di diffusione oggi sono comunemente utilizzate per valutare le regioni che hanno subito danni da ictus

Diffusione nell`Ictus Acquisizione dopo 4 ore dall`esordio

Functional MRI (fMRI) Riposo Attività FMRI è una tecnica utilizzata per misurare la variazione di ossigeno durante l`attività neuronale Riposo Attività L`incremento dell`attività neuronale comporta un aumento del segnale MR

Paradigma riposo task 8 blocchi di ripetizioni del task per 20 s In ogni blocco vengono acquisite 10 immagini

Segnale fMRI Andamento del segnale temporale al massimo dell’attivazione durante il task (in rosso il regressore).

Segnale fMRI Fittinf del segnale temporale al massimo dell’attivazione durante il task (blu) e il segnale (rosso) .

fMRI finger tapping

Paradigma riposo task 8 blocchi di ripetizioni del task per 20 s In ogni blocco vengono acquisite 10 immagini

fMRI scacchiera tremolante

MRI MRS Fornisce informazioni biochimiche basate sulla quantificazione di metaboliti intracellulari 1H 13C 31P 23Na 19F Fornisce informazioni anatomiche basate sulla localizzazione spaziale del segnale dell’acqua 1H

Quantificazione assoluta Significa calcolare la concentrazione molare dei metaboliti: Esterno: una soluzione a concentrazione nota. Il segnale generato confrontato con quello dei metaboliti Interno: Preso come riferimento un metabolita a concentrazione nota (ATP, H2O).

Il segnale nel dominio delle freqeunze dominio delle frequenze NAA Cr Cho mI Trasf. Fourier dominio del tempo Infatti una funzione f(t) può essere solitamente espressa (dipende dalla sua continuità) da una serie di Fourier cioè una serie infinita di seni e coseni in un periodo 2T. E’ più facile per l'occhio umano valutare lo spettro nel dominio delle frequenze perché i segnali dei metaboliti sono risolti e rappresentati in “picchi”

Il rapporto segnale/rumore (SNR) Il segnale NMR Dipende dal rapporto giromagnetico g, dall’abbondanza naturale del nucleo e dal campo magnetico:  g N B0 Il rapporto segnale/rumore (SNR) Il rivelatore registra non solo il segnale ma anche il rumore durante l’esperimento per questo si definisce il rapporto SNR per valutare uno spettro. Il rumore è dovuto al moto termico delle particelle in un conduttore In questo caso il conduttore che costituisce la bobina. Esso è prodotto in ogni sistema reale dissipativo che si trovi a temperatura diversa dallo zero assoluto per la fluttuazione dei portatori di carica entro un elemento conduttore. Infatti il rumore dipende dalle caratteristiche della bobina. La rappresentazione del rumore termico è data da una gaussiana con valore medio nullo proprio perché casuale.

Signal Noise Ratio (SNR) Dipende da: Il nucleo che si guarda (g) L’abbondanza naturale Il volume che contribuisce al segnale (Vc) La concentrazione del nucleo all’interno del volume Il campo magnetico (B0) La bobina (B1) Il numero di acquisizioni o medie (n) La sequenza di impulsi

Calcolo SNR SNR= Signal/Noise S = Area picco massimo dev. std. (noise) rapporto si calcola su di uno spettro disegnato; con un decimetro si misurano dalla linea di base media l’altezza del picco più alto e poi (amplificando il disegno dello spettro) l’ampiezza (picco/picco) del rumore su un campo più largo possibile . Quest’ultimo numero deve poi essere moltiplicato per 2,5 per trasformare l’ampiezza del rumore, letta una sola volta, nella deviazione standard della distribuzione delle ampiezze del rumore, in modo da simulare moltissime letture e rendere il dato statisticamente valido. Si utilizza la deviazione standard perché il valor medio del rumore calcolato su un gran numero di campioni è 0

Perché acquisire più medie Spettro del muscolo: 32 medie

Spettro del muscolo: 8 medie

La gaussiana,va a zero più velocemente rispetto alla lorentziana Apodizzazione Manipolazioni dei dati nel dominio del tempo, senza alterare le frequenze, per migliorare SNR. L’SNR migliora perché diminuisce il rumore ma diminuisce anche S (in misura inferiore) . Filtro Gaussiano Filtro Lorentziano La gaussiana,va a zero più velocemente rispetto alla lorentziana

31P MRS muscolo scheletrico So LG MG coil ATP a b g PCr Pi PME PDE Si distinguono alfa, beta, gamma fosfato dell’ATP, fosfocreatina, fosfato inorganico, fosfomonoesteri, fosfodiesteri. PME viene da una miscela di monosaccaridi fosforilati intermedi della glicolisi (nel cervello invece da intermedi della biosintesi dei lipidi di membrana). I PDE vengono sempre dal catabolismo dei fosfolipidi di membrana. Il Pi è dovuto alle forme ioniche degli acidi fosforici H2PO4- e HPO4= che risuonano a diverse frequenze ma essendo in rapido equilibrio danno luogo ad un unico segnale. Aumento SNR tramite somma spettri e apodizzazione

Quantificazione assoluta [PCr], [Pi] ATP standard interno; [ATP] = 8.0 mM e calcolare: pH, [Mg2+], [ADP] PCr ATP g a b Pi pH dPi Mg2+ dATPb 10 -10 -20 ppm

Preprocessing Somma Fase

Elaborazione spettri Calcolo dell`area sottesa ad ogni picco dello spettro AMARES è un algoritmo operatore dipendente ATP a b g PCr Pi PDE 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10

Risultati elaborazione spettri dPi=Freq(Pi) – Freq(PCr) Pi PCr b-ATP [PCr] = Ampl(PCr) / Ampl(b-ATP) * 8 mM [Pi] = Ampl(Pi) / Ampl(b-ATP) * 8 mM

Valutazione elaborazione spettri Valutazione elaborzione: Qualitativamente: l’ampiezza dei residui dei segnali Quantitativamente: 1 SNR (dato da PCr/noise) 2 CRB: 2* SD/Ampiezza S

Cramer-Rao Bound CRB: 2*SD/Ampiezza S CRB(Pi)0.079=7.9%

31P MRS a diverse condizioni metaboliche serve a valutare: funzionalità respiratoria mitocondriale individuale

Esercizio Flessioni plantari isocinetiche di intensità crescente

ATPasi miosinica ATP + H2O ADP + Pi PCr + ADP +H+ Cr + ATP Creatina chinasi

PCr Pi ATP ) 68 . 5 ( 9 3 log 77 6 Pi pH d - + = pH end-ex = 6.65 dPi pH rest = 7.06 pH end-ex = 6.65 ) 68 . 5 ( 9 3 log 77 6 Pi pH d - + = Pi ATP ATP dPi Row   

1H MRS NAA Cr Cho mI Single-voxel Multi-voxel

Single voxel 1H-MRS RF z Gz x z Gx y Gy x z Segnale Il segnale viene acquisito in assenza di gradienti per mantenere l’informazione del chemical shift. Per questo la codifica spaziale del volume che si vuole selezionare viene fatta prima dell’acquisizione del segnale.

Single voxel 1H-MRS Lip NAA, N-acetil aspartato: marker neuronale Cho Cr m-I Lip Lac Glx s-I ppm 3 4 2 1 NAA, N-acetil aspartato: marker neuronale Glx, glutammato+glutammina: neurotrasmettitori Cr, creatina+fosfocreatina: marker metabolismo energetico Cho, composti colinici: marker gliale mI, mio-inositolo: marker della osmoregolazione sI, scillo-inositolo: marker della funzionalità di membrana Lac, lattato: marker metabolismo glucidico Lip, lipidi: marker del metabolismo lipidico

Cr NAA Cho -OOC - CH- CH2- COO- NH CO CH3 NH H2N C N CH2 COO- CH3 HO CH2 CH2 N(CH3)3

H2N C N CH2 COO- CH3 NH Cr

HO CH2 CH2 N(CH3)3

Segnale dell’acqua in 1H-MRS H2O  55M NAA Metaboliti pochi mM

Soppressione dell’acqua Segnale dell’acqua non soppersso Segnale dell’acqua soppresso

Quantificazione assoluta I Conc[met] Conc[water]S[metab]/S[water] Utilizziamo come riferimento interno il picco dell`acqua Abbondante concentrazione  55 M Ottimo SNR La quantificazione assoluta of Cho, Cr e NAA dipende dagli effetti dei tempi di rilassamento T1 e T2. (Rutgers et all, 2002) Perché il segnale sia dell’acqua che dei metaboliti per rappresentare la concentrazione non deve dipendere da parametri di acquisizione Conc[met] Conc[water]S[metab]/S[water] µ

Quantificazione assoluta II S0(met): segnale dei metaboliti estrapolato al tempo 0 S0(H2O): segnale dell’acqua estrapolato al tempo 0 numAcq(H2O): numero di acquisizioni dello spettro dell’acqua numAcq(met): numero di acquisizioni dello spettro dei metaboliti numH(H2O): numero protoni che contribuiscono al segnale dell’acqua (2) numH(met): numero protoni che contribuiscono al segnale del metabolita

T2: Tempo di rilassamento trasversale più è lungo il T2 più il segnale decade lentamente

Quantificazione assoluta III Decadimento acqua Ampiezza del segnale T2 Acqua T2 Metaboliti TE

Influenza TE nello spettro TE 35 ms TE 70 ms Lipidi, T2 corto

Passi dell’elaborazione Peak-Peaking con AMARES NAA Cr Myo Cho Glx

Risultato Amares Macromolecole A bassi TE non è possibile valutare il segnale delle macromolecole che comporterà un errore nella valutazione dei metaboliti Macromolecole

LCModel