MONITORAGGIO DI LABORATORIO DELLA TERAPIA ANTITROMBOTICA DOMENICO PRISCO Centro Trombosi Azienda Universitaria Ospedaliera Careggi – Firenze

TERAPIA ANTITROMBOTICA Antipiastrinica Anticoagulante: Eparina LMWH Anticoagulanti orali Trombolisi Nuovi anticoagulanti Centro Trombosi Firenze

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Routes to inhibiting platelet function Centro Trombosi Firenze

Test di funzionalità piastrinica e trattamento antipiastrinico Nessuno studio è stato in grado di dimostrare l’utilità di eseguire il tempo di sanguinamento o test di aggregazione piastrinica in vitro ai fini di predire, nel singolo paziente, l’efficacia antitrombotica o il rischio emorragico in corso di trattamento antipiastrinico Dunque la terapia antipiastrinica NON DEVE essere monitorizzata in laboratorio!! E’ possibile che nei prossimi anni questo dogma sia sfidato da nuove metodiche di studio, almeno in certi casi, ma al momento esso resta valido Centro Trombosi Firenze

Resistance to Aspirin Inhability of aspirin in some healthy individuals or patients To protect from thrombotic complications To cause a prolongation of bleeding time To inhibit platelet aggregation (in vitro or ex vivo) To suppress platelet thromboxane A2 formation (and its urinary excretion) To exert its pharmacological effects over time, following chronic treatment Centro Trombosi Firenze

Tests based on response to platelet agonists Point of care test/instruments that can be used to assess platelet-related abnormalities associated with cardiac surgery Bleeding time Tests based on response to platelet agonists Rapid platelet function assay (RPFA)/Ultegra instrument (agglutination of fibrinogen-coated beads) Chronolog whole-blood aggregometer (electrical impedence) PFA-100 or Thrombostat (aperture- closure time/flow rate) ICHOR (reduction in platelet count) hemoSTATUS/Hepcon (PAF-mediated acceleration of clot times expressed as clot ratio values) Despotis, 2000 Centro Trombosi Firenze

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Eparina: effetto anticoagulante Il meccanismo anticoagulante dell’eparina è rimasto oscuro fino al 1973 E’ principalmente determinato da un’unità pentasaccaridica Tale unità, presente solo in 1/3 delle molecole di eparina, è dotata di alta affinità di legame per l’antitrombina Centro Trombosi Firenze 4

Struttura pentasaccaridica dell’eparina Centro Trombosi Firenze

hep TFPI Xa AT trombina VII/VIIa TF IX, X IXa VIIIa X Xa Va II Via del fattore tissutale VII/VIIa TF IX, X Fase di contatto Tenasi Xa Protrombinasi IXa VIIIa X APC-PS Xa Va hep AT II trombina fibrina fibrinogeno Centro Trombosi Firenze

Eparina: meccanismo d’azione Per inibire la trombina è richiesta la formazione di un complesso ternario AT-eparina-trombina Per inibire il Xa è sufficiente il legame AT-eparina Le molecole con meno di 18 unità monosaccaridche (PM<5.400) non sono in grado di legare contemporaneamente AT e trombina Centro Trombosi Firenze 4

Inattivazione della trombina Centro Trombosi Firenze

Inattivazione del fattore Xa Centro Trombosi Firenze

TEST di LABORATORIO PER MONITORIZZARE LA TERAPIA CON EPARINA NON FRAZIONATA COAGULATIVI aPTT TT CROMOGENICI Anti-Xa Anti-IIa Centro Trombosi Firenze

Test COAGULATIVI (I) Misurano il tempo necessario per ottenere la coagulazione di un campione di plasma citratato dopo aggiunta di opportuno reattivo. La presenza di eparina provocherà un allungamento del tempo di coagulazione direttamente correlato alla concentrazione eparinica. Centro Trombosi Firenze

Test COAGULATIVI (II) aPTT - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di sostituti del fattore piastrinico 3 (cefalina) associati ad attivatori della fase di contatto (ac.ellagico, silice micronizzata, caolino)  studia la via intrinseca e la via comune della coagulazione. TT - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di concentrazioni ottimali di trombina  studia la fibrino-formazione Centro Trombosi Firenze

Test CROMOGENICI (anti-FXa , anti-FIIa) Si valuta la concentrazione eparinica attraverso la capacità di inibire il fattore Xa (o il fattore IIa). Centro Trombosi Firenze

TEST CROMOGENICI Substrato proteico + Gruppo cromoforo specifico x F.Xa (F.IIa) F.Xa (F.IIa) Plasma + + Reazione competitiva x il F.Xa (F.IIa) F.Xa libero (F.IIa) Inattivazione F.Xa (F.IIa) proporzionale alla concentrazione eparinica Degradazione substrato proteico Lettura allo spettrofotometro Centro Trombosi Firenze

EPARINA NON FRAZIONATA: MONITORAGGIO DI LABORATORIO L’aPTT ratio rappresenta il test piu’ diffuso per il monitoraggio della terapia eparinica. Range terapeutico ottimale = 1.5-2.5 x v.n., corrispondenti a livelli di attività anti-Xa = 0.3-0.7 U/ml. ALCUNI PROBLEMI DI LABORATORIO Modalita’ del prelievo. Diversa sensibilita’ dei reagenti in uso all’eparina. Valore di aPTT del plasma normale di riferimento. Centro Trombosi Firenze

Typical aPTT pattern in patients on continuous heparin infusion 80 75 70 65 60 Mean PTT (seconds) 55 50 45 40 35 1 2 3 4 5 Day of therapy Hull et al. 1986 Centro Trombosi Firenze

NOMOGRAMMA PER INFUSIONE EPARINICA EV N.B. Il prelievo va eseguito sull’arto controlaterale rispetto all’infusione BOLO U/Kg UI/Kg/24 ore mL/Kg/ora mL/ora per un paziente di circa 70 Kg Controllo PTT dopo ore ( + 2) Dose iniziale 80 432 0.043 3.0 6 PTT < 1.5 + 96 +0.01 +0.7 1.5 < PTT < 2.0 40 + 48 +0.005 +0.4 2.0 < PTT < 2.8 --- Invariata 12 2.8 < PTT < 3.5 -48 -0.005 -0.4 PTT > 3.5 Stop 1 ora, poi –72 -0.007 -0.5 Centro Trombosi Firenze

LIMITI DELL’EPARINA NON FRAZIONATA NELLA TERAPIA DEL TEV Errori di laboratorio Può provocare piastrinopenia (1-5%) Somministrazione e.v. piu’ efficace rispetto a quella s.c. Il 60% dei pazienti trattati é iper- o ipo-scoagulato Fino al 4% di emorragie maggiori durante il periodo di infusione Centro Trombosi Firenze

EPARINA NON FRAZIONATA: PROBLEMI DELL’aPTT La correlazione tra prolungamento dell’aPTT ed eparinemia non è lineare L’intervallo terapeutico attualmente raccomandato è stato in origine derivato da studi sui conigli I reagenti commerciali per la determinazione dell’aPTT sono cambiati negli anni e hanno sensibilità assai diverse all’eparina: valori di anti-Xa fra 0.3 e 0.7 possono corrispondere a range di APTT ratio fra 1.6-2.7 e 3.7-6.2!! Gli intervalli terapeutici andrebbero stabiliti localmente in base al reagente utilizzato Centro Trombosi Firenze 7

PIASTRINOPENIA DA EPARINA Reazione avversa all’eparina, anticorpo-mediata (complessi immuni eparina-PF4-IgG attivano le piastrine), che può provocare: Improvvisa ed inspiegabile  >50% PLTs Trombosi venose e/o arteriose Lesioni cutanee nel sito d’iniezione Più frequente con ENF (1-5%) che con LMWH (0-1%) Controlli periodici dell’emocromo durante la terapia eparinica 6th ACCP Consensus Conference, Chest 2001 Centro Trombosi Firenze

RESISTENZA ALL’EPARINA (I) Pazienti che richiedono ENF >35.000 U/24 ore Incidenza: fino al 25% dei pazienti con TEV Cause: Deficit di AT-III  Clearance eparina  Proteine leganti eparina  F.VIII, Fibrinogeno, PF4 6th ACCP Consensus Conference, Chest 2001 Centro Trombosi Firenze

RESISTENZA ALL’EPARINA (II) Somministrare dosi di ENF in grado di mantenere livelli di anti-Xa= 0,3-0,7 UI/ml. I pazienti che vengono monitorati mediante l’attività anti-Xa ricevono, a parità di efficacia, dosi inferiori di ENF rispetto a quelli controllati con l’aPTT Monitorare l’UH mediante l’anti-Xa è particolarmente indicato nei pazienti ad alto rischio emorragico. 6th ACCP Consensus Conference, Chest 2001 Centro Trombosi Firenze

STRUMENTI POINT-OF-CARE PER MONITORIZZARE IL TRATTAMENTO EPARINICO E LA SUA NEUTRALIZZAZIONE Centro Trombosi Firenze

Point of care test/instruments that can be used to assess nonplatelet hemostatic abnormalities associated with cardiac surgery Unneutralized heparin or heparin-rebound ACT-based tests Celite or kaolin ACT (Hemochron series instruments) Kaolin ACT or heparinase test cartridge - (ACT II or Hepcon instruments) I-STAT celite ACT Son ACT (Sonoclot instruments) ICHOR ACT Non-ACT tests Heparin management test (HMT/LHMT- TAS system) Thrombin time/heparin neutralized thrombin time (Hemochron series instruments) Heptest anti-II/Xa activity Despotis, 2000 Centro Trombosi Firenze

INSTRUMENTS FOR MONITORING HIGH-DOSE HEPARIN THERAPY (Manufacturer) SAMPLE Size SAMPLE Type ASSAY ACTIVATORS Actalyke (Helena Point of Care) 1) ACT 2) MAX-ACT 1) Celite or Kaolin 2) Celite, Kaolin, glass coctail 1) 1 mL 2) 0.5 mL FWB Hemotec ACT II/Hepcon HMS (Medtronic Inc.) ACT Kaolin 0.4 mL (x2) F WB Coaguchek Pro (Roche diagnostics) Celite 1 drop GEM PC (IL) Hemochron Jr Signature (ITC) ACT+ Kaolin with silica and phospholipid Hemochron series – 401, 801, 8000, Response – (ITC) Celite or Kaolin 2.0 mL I-STAT (Abbott Laboratories) ACT (?) 40 µL Rapidpoint Coag/TAS (Bayer Diagnostics) HMT Citr WB Centro Trombosi Firenze

Hemochrom versus HemoTec ACT target values Average of Hemochrom and HemoTec (seconds) Varga et al 1995 Hemochrom versus HemoTec ACT target values during Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty -200 -100 200 300 400 100 Difference in Hemochrom and HemoTec (seconds) 500 600 700 800

Limitations of ACT in heparin monitoring 7 N=32 6 5 HC ACT (sec/100) Temp (°C/10) 4 HT ACT (sec/100) 3 Anti-Xa (IU/ml) 2 WB Hep (IU/ml) Hct (%/10) 1 Start CBP Stop CPB Hep Hypoth Rewarming -60 -30 30 60 90 120 150 Cardiopulmonary Bypass Time (min) Despotis,1997 Centro Trombosi Firenze

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EBPM TFPI Xa AT trombina VII/VIIa TF IX, X IXa VIIIa X Xa Va II Via del fattore tissutale VII/VIIa TF IX, X Fase di contatto Tenasi Xa Protrombinasi IXa VIIIa X APC-PS Xa Va AT II EBPM trombina fibrina fibrinogeno Centro Trombosi Firenze

LMWH Si somministra a dosi fisse, stabilite in base al peso del paziente. In genere non è necessario il monitoraggio fatta eccezione per alcuni sottogruppi: Insufficienza renale Obesità Sottopeso Bambini Gravidanza Anziani ad alto rischio emorragico Centro Trombosi Firenze

MONITORAGGIO LMWH (I) come e quando effettuare il controllo di laboratorio Emocromo, prima di iniziare il trattamento, poi dopo 5-7 e 10-15 giorni di trattamento con LMWH Dosaggio anti-Xa, (metodo cromogenico) Profilassi v.rif. 0.2-0.4 UI anti-Xa /ml Terapia v. rif. da 0.6 a 1.5 UI anti-Xa /ml NB valori diversi da quelli dell’eparina non frazionata! Prelievo per attività anti-Xa alla 3°-4° h dalla somministrazione Centro Trombosi Firenze

MONITORAGGIO LMWH (II) L’attività anti-Xa rappresenta la quota di eparina presente nel plasma ma non necessariamente ne riflette l’effetto antitrombotico o proemorragico. La comparabilità tra le varie metodiche anti-Xa disponibili in commercio è modesta. Dovrebbero esistere metodi specifici per le diverse LMWH e per l’attrezzatura utilizzata SCC, Thromb Haemost 2002 Centro Trombosi Firenze

EBPM: cose da ricordare Le unità di EBPM non hanno nulla a che vedere con le unità di eparina Le EBPM sono diverse, con indicazioni e dosaggi propri di ogni molecola (anche se molto simili) Le EBPM vanno usate con molta cautela nei pazienti con insufficienza renale L’iniezione SC va eseguita in modo accurato Centro Trombosi Firenze 7

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Warfarin Mechanism of Action Warfarin works by interfering with internal recycling of oxidized Vitamin K to the reduced form. When warfarin is given, the oxidized form of Vitamin K builds up in the blood leading to a deficiency of reduced Vitamin K and a decrease in carboxylation of prothrombin. Warfarin interferes with g–carboxylation of terminal glutamic acids on the procoagulant proteins, Factors II, VII, IX, and X. g–carboxylation from the Glu to the Gla form of these proteins in a critical step in the biosynthesis of these proteins that is required their normal function in coagulation. g–carboxylation is a post-translational step that is Vitamin K dependent and linked to the oxidation of hydroquinone (the active cloting form of Vitamin K) to the Vitamin K epoxide. The reaction uses molecular oxygen for the conversion of hydroquinone to the epoxide, and CO2, for the g–carboxylation of the glutamic acid residues on the Vitamin K dependent proteins from the inactive carboxylation of the glutamic acid residues on the Vitamin K dependent proteins from the inactive Glu to the active Gla form. Under normal physiologic circumstances, Vitamin K is absorbed as the quinone form (Vitamin K1). The quinone is reduced to the hydroquinone (the reduced form), which in turn is oxidized to Vitamin K epoxide (the oxidized form). The active cofactor form of Vitamin K (hydroquinone) is then regenerated through two reduction steps. First the 2–3 epoxide is reduced to the quinone (the dietary source of Vitamin K1). This is then reduced to the hydroquinone which, when recycled to the epoxide, acts as the cofactor for the Glu to Gla conversion of the Vitamin K dependent coagulation factors by blocking both reduction steps, thereby depleting the stores of the hydroquinone form of Vitamin K. Centro Trombosi Firenze

Conseguenze dell’effetto indiretto della TAO Variazioni individuali di affinità recettoriali Variazioni individuali della disponibilità di vitamina k Variazioni farmacodinamiche per cause fisiopatologiche (stati di ipermetabolismo) Variazioni da interferenze farmacologiche -----> inutile dosare il livello plasmatico del farmaco -----> necessità di conoscere l’effetto biologico § Fra le diverse possibilità di monitoraggio, in pratica, si usa il tempo di protrombina (PT) § Possibili espressioni del PT: Tempo Attività Ratio Index ( reciproco del Ratio) § Variabilità del ratio con diverse tromboplastine Centro Trombosi Firenze

Patient’s PT in Seconds Mean Normal PT in Seconds INR Equation ( ) Patient’s PT in Seconds Mean Normal PT in Seconds ISI INR = INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index The INR is calculated by the formula shown on this slide. The ISI is the International Sensitivity Index. Each thromboplastin is assigned an ISI which reflects the sensitivity of the thromboplastin to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. By convention, the ISI of the reference thromboplastin is 1.0. The higher the ISI, the less sensitive the thromboplastin is to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. The next two slides provide an example of how the ISI (sensitivity) of the thromboplastin influences the PT ratio (PTR) and how the resulting variability is corrected by expressing the results as an INR. Centro Trombosi Firenze

How Different Thromboplastins May influence the PT Ratio and INR Patient’s PT (Seconds) Mean Normal (Seconds) Thromboplastin Reagent PTR ISI INR A 16 12 1.3 B 18 12 1.5 This slide shows the results of the PT (expressed both as a time in seconds and a PTR) performed on five aliquots of the same plasma sample using five thromboplastins with different ISI values. The results of the PTR varies among the five aliquots of the same test plasma, reflecting the variability in the sensitivities of the thromboplastins. C 21 13 1.6 D 24 11 2.2 E 38 14.5 2.6 Centro Trombosi Firenze

How Different Thromboplastins May influence the PT Ratio and INR Patient’s PT (Seconds) Mean Normal (Seconds) Thromboplastin reagent PTR ISI INR A 16 12 1.3 3.2 2.6 B 18 12 1.5 2.4 2.6 This slide is similar to the last one, but the results of the ISI values of the five thromboplastins and the corresponding INR values are added. It is clear that the marked variability of the PTR is normalized by expressing the results as an INR. C 21 13 1.6 2.0 2.6 D 24 11 2.2 1.2 2.6 E 38 14.5 2.6 1.0 2.6 Centro Trombosi Firenze

Vantaggi dell’INR Univoca quantificazione del livello di anticoagulazione Normalizzazione della variabilità fra diversi lotti di tromboplastine Possibilità di movimento dei pazienti Possibilità di un linguaggio comune fra i Centri Definizione dei range terapeutici ottimali per le diverse patologie Possibile utilizzo dei risultati degli studi Centro Trombosi Firenze

VARIABILI PREANALITICHE NEI TEST PER IL MONITORAGGIO DELLA TERAPIA CON EPARINE E AO Prelievo di sangue Temperatura Provetta Anticoagulante Rapporto Anticoagulante/Sangue Emolisi Trasporto del campione Centrifugazione Conservazione del Campione Centro Trombosi Firenze

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TROMBOLISI TERAPEUTICA Centro Trombosi Firenze

MARKER DI LABORATORIO COME INDICATORI DEI PARAMETRI VASCOLARI ED EMATOLOGICI DELLA TROMBOLISI Effetto vascolare Effetto ematologico MARKER POTENZIALE Riperfusione Trombolisi Ipofbg, D-Dimeri, FbDP Emorragia Lisi tappi emostatici Aumento t.emorr, ipofbg Non riperfusione o occlusione Trombogenicità lesione vascolare FPA, fbg elevato, frammento F1+2, fb solubile Emorragia tardiva Stato ipocoagulabilità Stato litico persistente, t.emorr. prolungato Pervietà del vaso persistente Ipofbg, tempo emorr. prolungato, disfunzione plt Centro Trombosi Firenze

VALORE PREDITTIVO DELLE ALTERAZIONI DI LABORATORIO PER EMORRAGIA Predittori di emorragia: età avanzata basso peso corporeo sesso femminile razza africana, e non le alterazioni di laboratorio!! Centro Trombosi Firenze

VALORE PREDITTIVO DELLE ALTERAZIONI DI LABORATORIO PER RIPERFUSIONE E RETROMBOSI Parametri di laboratorio non sono predittivi di riperfusione o retrombosi Centro Trombosi Firenze

VALORE DELLE ALTERAZIONI DI LABORATORIO NEL MONITORAGGIO DELLA TROMBOLISI Dosi di attivatori del plg : STANDARD Solo durata di infusione può essere variata Parametri di laboratorio utili solo per dimostrare efficacia di dose nel produrre stato litico sistemico Infusione molto breve nel caso di IMA o EP Una volta ottenuto lo stato litico: non è necessario variare la dose in base a parametri di lab poiché non influenzano esito o eventi avversi Dopo trombolisi, dimostrazione recupero stato litico (fbg:6-36 h) utile per poter iniziare farmaci antitrombotici come eparina o anticoagulanti Centro Trombosi Firenze

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Bersaglio dei nuovi farmaci antitrombotici. Steps in Coagulation Drug coagulation cascade Initiation TF/VIIa TFPI NAPc2 X IX IXa VIIIa APC Va Xa Pentasaccharide DX9065a Hirudin, Bivalirudin Dermatan sulphate Argatroban Ximelagatran Fibrinogen Fibrin Propagation Bersaglio dei nuovi farmaci antitrombotici. II Thrombin activity IIa Centro Trombosi Firenze

Measurement of synthetic pentasaccharide fondaparinux (Arixtra) anti-Xa activity F. Depasse*, G. T. Gerotziafas+, P. Van Dreden‡, S. Fontaine‡ & M. M. Samama+ *LCL, France; +Hôpital Hotel-Dieu de Paris, France; ‡Serbio Laboratory, France …….These three chromogenic assays can be used for fondaparinux anti-Xa activity monitoring. However, both STA-Rotachrom® Heparin and Coatest® LMWH assays demonstrated to be more sensitive and to give a linear response in a wider range of fondaparinux plasma concentrations than the Stachrom Heparin assay The results of the anti-Xa activity of fondaparinux should be expressed on a gravimetric basis (µg mL-1) of fondaparinux ISTH 2003 Centro Trombosi Firenze

APTT and melagatran 0,5 1 1,5 2 2,5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0, 0,7 0,8 0,9 Plasma concentration ( m mol /L) APTT-ratio y = 0.890 + 1.097 * sqrt (x) R = 0.570 Centro Trombosi Firenze

ECT correlated to plasma concentration in patients treated with melagatran ECT Studies 1 + 2 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 50 100 150 200 250 300 Ecarin Clotting Time (sec) Cp Melagatran (µmol/L) Centro Trombosi Firenze