La variabilità genetica nei batteri Le due cellule figlie sono geneticamente identiche tra loro e alla cellula madre

La variabilità genetica nei batteri Nella maggioranza dei casi le mutazioni sono deleterie…..

La variabilità genetica nei batteri …..ma in qualche caso possono conferire un vantaggio!

Le basi molecolari delle mutazioni Mutazione: è un cambiamento ereditario nella sequenza delle basi nel genoma di un organismo Mutazioni puntiformi possono risultare per sostituzione di una base nel DNA o per inserzione e delezione di una base (microinserzioni e microdelezioni). Il cambiamento del fenotipo dipende dal punto esatto in cui la mutazione è situata nel gene e da quale prodotto è normalmente codificato dal gene. Mutazioni che coinvolgono molte paia di basi Le delezioni possono coinvolgere la perdita di centinaia o migliaia di paia di basi; non revertono se non per ricombinazione. Le inserzioni si verificano per aggiunta di nuove basi al DNA e inattivano il gene in cui accadono. Molte mutazioni da inserzione sono dovute a sequenze di DNA specifiche, lunghe 700-1400 bp, dette sequenze di inserzione. Le mutazioni da inserzione possono revertere.

Effetti della sostituzione di una base mutazione missenso mutazione nonsenso mutazione silente

Scivolamento dello schema di lettura (frameshift)

Frequenza di mutazione La frequenza con cui avvengono i diversi tipi di mutazioni è estremamente variabile. Errori nella replicazione del DNA ricorrono con una frequenza di 10-7 10-11 per coppia di basi per singolo ciclo di replicazione. Per un gene di 1000 basi la frequenza è dell’ordine di 10-4 10-8 per generazione Retromutazione e Soppressione Un revertante è un ceppo in cui viene ripristinato il fenotipo selvatico Reversione vera (retromutazione) Reversione di secondo sito (soppressione) mutazione frameshift mutazione in un secondo gene Reversione di mutazione nonsenso Reversione di delezioni e inserzioni Grosse delezioni possono revertere solo mediante processi che coinvolgono la ricombinazione genetica. Alcune inserzioni (elementi trasponibili) possono revertere per escissione.

La Mutagenesi Le mutazioni possono essere: Spontanee Indotte da mutageni (frequenza molto bassa) Mutageni chimici Mutageni fisici Analoghi delle basi Agenti alchilanti Agenti intercalanti Radiazioni non ionizzanti:UV Radiazioni ionizzanti: raggi gamma raggi X raggi cosmici

Analoghi delle basi T : A BrU : A BrU : G BrU : A C : G Simili nella struttuta a purine e pirimidine del DNA ma difettosi nell’appaiamento Il più delle volte la replicazione avviene normalmente ma occasionalmente può verificarsi un errore che verrà fissato come mutazione nel successivo ciclo di replicazione T : A BrU : A BrU : G BrU : A C : G

Agenti alchilanti Agenti intercalanti Nitrosoguanidina, Acido nitroso, Idrossilamina sono responsabili di reazioni di metilazione, deaminazione, ecc. Mutageni molto potenti e inducono mutazioni ad alta frequenza rispetto agli analoghi delle basi. Reagendo sul DNA sono in grado di introdurre cambiamenti anche in assenza di replicazione Agenti intercalanti Acridine (arancio di acridina, proflavina): sono molecole planari che si inseriscono tra due basi del DNA, separandole Questa conformazione anormale può portare a microinserzioni e microdelezioni durante la replicazione

Radiazioni non ionizzanti: raggi UV Le basi degli acidi nucleici assorbono efficientemente la radiazione ultravioletta. Il picco di assorbimento è a 269 nm La radiazione UV a 260 nm è l’agente letale più efficiente Il suo effetto più conosciuto sul DNA è la formazione di dimeri di pirimidine (due C o T adiacenti vengono legate covalentemente tra loro). Induzione del sistema SOS. La presenza di dimeri aumenta la probabilità che la DNA polimerasi inserisca in questa posizione un nucleotide errato. La radiazione UV è uno strumento molto utile nell’isolamento di mutanti

Radiazioni ionizzanti Sono radiazioni a lunghezza d’onda corta (raggi X, gamma, raggi cosmici). Più potenti dei raggi UV e altamente penetranti. Causano la ionizzazione dell’acqua e di altre sostanze con la produzione di radicali liberi come lo ione ossidrile (OH-) La loro azione mutagena è indiretta in quanto il danno è prodotto dai radicali liberi.

La variabilità genetica nei batteri Le mutazioni puntiformi non sono sufficienti a spiegare la diversità del mondo microbico Il genoma di un batterio risulta costituito da un “puzzle” di sequenze provenienti da altri batteri che non sono suoi progenitori ma suoi contemporanei Indifferenti al mantenimento della loro identità, i batteri sono capaci di acquisire da altri organismi geni che permettono loro: di diventare resistenti ad antibiotici causare nuove malattie aumentare la loro possibilità di sopravvivenza Lo scambio di DNA tra i batteri è chiamato: Trasferimento genico orizzontale

Trasferimento genico orizzontale Scambio di DNA tra batteri contemporanei Trasferimento genico verticale Eredità di un gene dal progenitore

Significato medico del trasferimento genico Il trasferimento genico orizzontale tra i batteri sta avendo effetti immediati e pratici sulla salute umana E’ stato dimostrato il trasferimento di geni: per la resistenza ad antibiotici responsabili della patogenicità per la degradazione di inquinanti (biorisanamento)

(ceppo che causa diarrea) E. coli O157:H7 (causa diarrea emorragica e geni per la tossina Shigella E. coli (ceppo che causa diarrea) E. coli O157:H7 (causa diarrea emorragica e danni renali) geni per la resistenza Ceppo X resistente alla penicillina Ceppo Y sensibile alla penicillina Ceppo Y resistente

Trasformazione Trasduzione Coniugazione

Trasformazione Processo in cui il DNA presente all’esterno del batterio viene internalizzato nella cellula ospite, integrato nel cromosoma nella corrispondente regione omologa e stabilmente ereditato con le divisioni cellulari

L’esperimento di Griffith (1928) Pneumococchi da colonie liscie (S= smooth) Pneumococchi da colonie rugose (R= rough) cellule vive S cellule vive R

L’esame batteriologico rivela batteri vivi di tipo S L’esperimento di Griffith (1928) cellule morte cellule vive cellule morte L’esame batteriologico rivela batteri vivi di tipo S

Trasformazione naturale Batteri Gram (+) Streptococcus pneumoniae e S. sanguis Bacillus subtilis, B. cereus, B. stearothermophilus Batteri Gram (-) Neisseria gonorrheae Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae Acinetobacter calcoaceticus Moraxella oslensis, M. urethalis Psycrobacter sp. Azotobacter agilis Pseudomonas stutzeri

Possibili benefici derivanti dalla trasformazione Acquisizione di nuove caratteristiche genetiche Riparo del DNA danneggiato DNA come fonte di nutrimento Superamento delle difese dell’ospite da parte dei patogeni (N. gonorrhoeae)

Le fasi del processo di trasformazione naturale sviluppo della fase di competenza legame del DNA trasformante alle cellule competenti ingresso del DNA trasformante integrazione del DNA (ricombinazione) espressione del DNA trasformante

Sviluppo della fase di competenza Nella maggioranza dei batteri la competenza è geneticamente regolata e si manifesta in condizioni ambientali particolari o in una fase specifica della crescita della popolazione Nei batteri Gram negativi ogni individuo di una popolazione sviluppa la competenza indipendentemente Nei batteri Gram positivi lo sviluppo della competenza è regolato da uno scambio di messaggi chimici (feromoni) tra le cellule di una popolazione

Batteri G negativi Batteri G positivi Neisseria gonorrhoeae La competenza è costitutiva. Quasi tutte le cellule di una coltura sono competenti e non c’è nessuna relazione con la fase di crescita Haemophilus influenzae La competenza è indotta da condizioni che inibiscono la crescita Batteri G positivi Streptococcus pneumoniae La competenza è controllata da un fattore extracellulare (ferormone) di 17 aa. Quasi tutte le cellule di una coltura in fase esponenziale diventano competenti quando il feromone raggiunge una concentrazione critica (quorum sensing). Il 100% delle cellule possono diventare competenti (per pochi minuti!). Il regulone com Bacillus subtilis La concentrazione critica di almeno due feromoni attiva la competenza. Si manifesta in tarda fase esponenziale o inizio di fase stazionaria. Solo il 10% dei batteri diventano competenti.

La trasformazione naturale in Streptococcus pneumoniae Il fattore di competenza attiva la produzione di altre proteine (>12) che permettono l’adsorbimento del DNA sulla superficie batterica. I frammenti di DNA sono generalmente lunghi 15-20 Kb. Una cellula competente è in grado di legare fino a 1000 volte più DNA di una cellula non competente Il DNA a doppia elica viene frammentato in piccoli frammenti per azione di nucleasi Un’elica del DNA viene degradata da una nucleasi mentre l’elica complementare entra nella cellula associata a proteine che la proteggono dalla degradazione Può entrare DNA di qualsiasi origine ma solo quello omologo viene integrato e produrre cambiamenti ereditari nella cellula ricevente

Batterio Gram positivo

La trasformazione naturale in Haemophilus influenzae Non vengono prodotti fattori di competenza E’ trasformabile solo da DNA appartenente a specie correlate Il DNA trasformante deve contenere una sequenza specifica di 11 bp. Questa sequenza è ripetuta diverse centinaia di volte nel proprio genoma Il DNA attraversa la membana esterna come doppia elica in vescicole di membrana Dallo spazio periplasmico entra nel citoplasma come singola elica

DNA trasformante ingresso SS-DNA D-loop cromosoma RecA DNA ligasi endonucleasi Pol III exo

La trasformazione artificiale La maggior parte dei batteri possono essere trasformati artificialmente Vengono utilizzati shock chimici e termici (CaCl2) o elettrici (elettroporazione) Il DNA viene introdotto integro nella cellula DNA lineare a doppia elica DNA plasmidico integrazione mediante ricombinazione omologa replicazione del plasmide

Lederberg & Tatum 1946

pressione o aspirazione cotone ceppo A ceppo B La coniugazione richiede un contatto cellula-cellula: quando le colture sono separate da un filtro poroso permeabile alle macromolecole ma non ai batteri, la ricombinazione non avviene! filtro poroso

Coniugazione Pili sessuali: presenti in numero di 1-10 per cellula, sono spessi 9-10 nm

donatore ricevente F F+ F- ponte coniugativo OriT

F+ F- Viene trasferito un filamento singolo di F. Nel ricevente viene sintetizzato il filamento complementare Una copia del cromosoma con F rimane nella cellula donatrice dopo la replicazione della singola elica restante

Il DNA può essere diviso in 4 regioni: 1. Regione tra (35 Kb) Il Fattore F IS3 gd IS2 inc, rep oriT A L E B C F H G S D I J K 94 Kb Il DNA può essere diviso in 4 regioni: 1. Regione tra (35 Kb) 2. Regione della replicazione (inc, rep) 3. Elementi trasponibili 4. Regione silente Regione tra: Sintesi ed assemblaggio dell’F pilus (13 geni) Mating-pair stabilization (2 geni) Metabolismo del DNA coniugativo (5 geni) Regolazione del trasferimento (3 geni) Esclusione di superficie (2 geni)

donatore ricevente Hfr F- OriT

Interruzione dell’accoppiamento Hfr F-

donatore ricevente Viene trasferito un filamento singolo di F insieme a una copia di parte del cromosoma del donatore. Nel ricevente viene sintetizzato il filamento complementare Una copia del cromosoma con F integrato rimane nella cellula donatrice dopo la replicazione della singola elica restante

Ricombinazione dopo coniugazione con Hfr esogenote endogenote

Modello di Campbell a b c d e a b c d e F 1 5 2 4 3 1 2 3 a b c d e OriT OriT a b c d e a b c d e 1 2 3 4 5 a b c d e 1 b c d e a 2 c d e a b 3

IS3 gd IS2 inc, rep oriT A L E B C F H G S D I J K 94 Kb

Gradiente di trasferimento

Il fattore F’ e la F-duzione Si ottiene in seguito a un errato processo di escissione di F La formazione di un F’ produce una delezione nel cromosoma In seguito ad incrocio: F’ x F- si produce un diploide parziale o merizigote

1. F+ 2. Hfr 3. F’ Ricapitolando…… Il fattore F può trovarsi nella cellula come: 1. F+ 2. Hfr 3. F’ da un incrocio…… i riceventi…… F+ x F- diventano F+ rimangono F- ma possono acquisire nuovi caratteri Hfr x F- F’ x F- diventano F’ e diploidi parziali per uno o più geni

Coniugazione in altri batteri Gram negativi Salmonella: Sono stati isolati diversi plasmidi coniugativi in ceppi naturali di Salmonella sp., ma per gli studi di genetica viene utilizzato l’F di Escherichia coli Pseudomonas: Molti plasmidi coniugativi e mobilizzabili sono stati descritti e molto studiati in ceppi di Pseudomonas. Il plasmide FP2 di P. aeruginosa può mobilizzare anche il cromosoma: mobilizzazione unidirezionale a partire da un solo sito cromosomale

Coniugazione in altri batteri Gram positivi Mediante plasmidi coniugativi simili al fattore F (Streptomyces) Mediata da FEROMONI (Streptococcus) responsabili di aggregazione cellulare Coniugazione traspositiva (Bacillus, Staphilococcus, Streptococcus) In Streptomyces coelicolor il plasmide SCP1 interagisce con il cromosoma batterico in diversi siti. Due differenze con F: trasferimento bidirezionale tutti i ricombinanti ottenuti sono fertili

I plasmidi Elementi genetici circolari, extracromosomali, capaci di replicazione autonoma (replicone) Le dimensioni variano da 1 Kb a >1000 Kb e il loro numero varia da 1 a diverse centinaia di copie per cellula ospite La loro informazione genetica non è essenziale per la cellula ospite ma può conferire un vantaggio selettivo in particolari condizioni Alcuni plasmidi possono esistere sia allo stato libero sia integrato nel cromosoma dell’ospite (episomi) Alcuni plasmidi si mantengono stabilmente all’interno della cellula, altri hanno la capacità di diffondersi attraverso la coniugazione

Plasmidi coniugativi e mobilizzabili IS3 gd IS2 inc, rep oriT A L E B C F H G S D I J K 94 Kb F+ F-

Plasmidi coniugativi e mobilizzabili

Plasmidi R Plasmidi col Plasmidi di virulenza Plasmidi metabolici Codificano per enzimi capaci di distruggere o modificare gli antibiotici come ampicillina, cloramfenicolo, tetraciclina, kanamicina ecc. Alcuni plasmidi portano un’unica resistenza, altri fino a otto. Possono essere anche coniugativi e diffondersi rapidamente. Plasmidi col Conferiscono un vantaggio al batterio portatore nei confronti di batteri della stessa specie o specie affini. Codificano per le batteriocine (colicine, subtilisine, ecc.) capaci di permeabilizzare le membrane o degradare gli acidi nucleici. Plasmidi di virulenza Portatori di tossine; rendono il ceppo batterico più patogeno. Il ceppo di E. coli responsabile della “diarrea del viaggiatore” è portatore di un plasmide codificante per una enterotossina. Plasmidi metabolici Codificano per enzimi capaci di degradare composti aromatici, pesticidi, zuccheri ecc. In alcuni ceppi di Rhizobium portano i geni necessari per la nodulazione nelle leguminose. B237 P302

Plasmidi di virulenza e malattie Molti batteri risultano patogeni a causa dei loro plasmidi Il plasmide porta geni per le tossine “ rende il batterio più capace di infettare l’ospite “ rende il batterio più resistente alle difese dell’ospite Ceppi enterotossici di E. coli provocano la diarrea del viaggiatore Tossina termolabile (LT) Tossina termostabile (ST) sono portate da plasmidi, a volte anche da un solo plasmide I ceppi enterotossici di E. coli devono essere anche capaci di colonizzare l’intestino Speciali fimbrie adesive sono codificate da geni di un altro plasmide Altri batteri patogeni portano plasmidi di virulenza Tossina tetanica di Clostridium tetani Antratossina di Bacillus anthracis

Incompatibilità fra plasmidi L’incompatibilità si osserva quando un plasmide entra in una cellula dove è già presente un plasmide simile. Il nuovo plasmide non può essere mantenuto e viene perso nei successivi cicli di divisione batterica. Il fenomeno è controllato dai geni coinvolti nella regolazione della replicazione plasmidica Plasmidi che condividono lo stesso sistema di replicazione appartengono allo stesso gruppo di incompatibilità (Inc) e sono tra loro incompatibili Perchè un batterio possa contenere diversi tipi di plasmidi, questi non devono essere strettamente correlati

Sistema host cell killing del plasmide R1 Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso numero di copie assicura il mantenimento del plasmide all’interno di una popolazione batterica hoc mRNA: emivita 20 min hok SD 128 bp sok sok mRNA: emivita < 1-2 min

Il sistema veleno-antidoto del plasmide F ccdA ccdB 72 AA 101 AA antidoto (facilmente degradabile) blocca l’attività di CcdB veleno (proteina stabile) interagisce con la DNA girasi

Trasduzione generalizzata Trasduzione specializzata Modalità si scambio genetico fra batteri mediato da un virus Trasduzione generalizzata Trasduzione specializzata Qualsiasi marcatore genetico può essere trasferito da un donatore a un ricevente Solo marcatori specifici possono essere trasferiti P22, P1 per Gram(-) l per E. coli PBS1 per Gram (+) SPb per B. subtilis Anche se non tutti i fagi trasducono e non tutti i batteri possono essere trasdotti, il fenomeno è sufficientemente diffuso da far supporre che svolga un ruolo importante nel trasferimento genico in natura B232

Lederberg e Zinder 1951 S.typhimurium infettato da P22 filtro poroso

testa collare coda guaina elicoidale piastra basale fibre caudali

Batteriofagi virulenti ciclo litico

Batteriofagi temperati ciclo litico ciclo lisogenico profago induzione

Il processo di infezione virale DNA batterico DNA virale

Trasduzione generalizzata I fagi capaci di dare trasduzione generalizzata devono possedere un meccanismo di impacchettamento del DNA che permetta il riconoscimento accidentale del DNA dell’ospite

Il fago trasducente (1/103 della popolazione virale) può infettare un altro batterio ma non iniziare un normale ciclo di infezione in quanto il DNA virale è assente (particella difettiva)

x x fago trasducente a+ a- La quantità di DNA batterico trasportata dipende dalle dimensioni del capside. Il fago P1 di E. coli trasporta 99 Kb (2% del cromosoma batterico) Nuovi alleli, o anche nuovi geni, possono essere integrati nel cromosoma ospite. Dal 70 al 90% del DNA trasdotto non viene integrato, ma può esprimersi per un numero limitato di generazioni, dando dei diploidi parziali (trasduzione abortiva) a+ x x a-

Trasduzione specializzata attP attB

l ldgal Escissione corretta Escissione errata (evento raro). Si genera una particella trasducente per il gene gal. Il fago è difettivo ldgal Lisato a bassa frequenza di trasduzione (lisato LFT)

Trasduzione per ricombinazione Le particelle trasducenti difettive possono aver perso alcuni geni essenziali per la propria riproduzione Hanno un sito di integrazione ibrido, non funzionale Trasduttanti stabili possono derivare dalla ricombinazione tra il cromosoma del fago e quello del batterio in seguito a due crossing-over su entrambi i lati del sito gal

Trasduzione in un batterio lisogeno I fagi ldgal possono integrarsi in un batterio lisogeno in quanto il sito att ibrido è identico a quelli generati dal profago Il fago normale fornisce anche i geni persi dal fago difettivo e viene chiamato fago helper, perché aiuta il fago difettivo a integrarsi e riprodursi I trasduttanti sono instabili perché il profago può essere indotto all’escissione Lisato ad alta frequenza di trasduzione (lisato HFT)

Caratteristiche comuni ai tre meccanismi di trasferimento genico 1. Solo una porzione del cromosoma è trasferita 2. Il trasferimento è sempre polarizzato DONATORE RICEVENTE 3. Il prodotto del trasferimento non è un vero zigote: per questo viene chiamato MERIZIGOTE 4. Il DNA trasferito (ESOGENOTE) può essere trasmesso alla progenie solo se viene incorporato nel genoma della cellula ricevente (ENDOGENOTE) CASO PARTICOLARE: trasferimento di un replicone (PLASMIDE) I processi di trasferimento genico hanno un ruolo importante nella variabilità genetica delle popolazioni batteriche in quanto assicurano la diffusione di materiale genetico e quindi l’acquisizione di nuovi caratteri