Jacopo Nicolò Toffanetti Studio dell’interazione tra liquidi ionici e doppi strati lipidici supportati mediante microscopia a forza atomica Jacopo Nicolò Toffanetti Aggiungi matricola, università degli studi..dip.,... Anno accedmico,.. Relatore...

Liquidi ionici a temperatura ambiente Struttura molecolare e caratteristiche Catione Anione Temperatura di fusione: Liquidi ionici <100 °C NaCl 804°C Prima i liquidi, poi la relazione con le membrane biologiche, di cui i bilayer sono un modello semplificato Questo catione e’ un caso particolare (imidazolium-based), come l’anione, devi dirlo Qui anche lo schema dell’anione e due info sul fatto che siano liquidi, magari ripoirta un valore di melting point e fai il confronto con il sale da cucina e la relativa temp di fusione Catione e anione del liquido ionico a base imidazolica di [Bmim][NTf2]

Liquidi ionici Possibili applicazioni Supercapacitori elettrochimici Chimica biologica Possibili applicazioni Applicazioni tribologiche Alternativa ai comuni solventi Realizzazione di pannelli solari Qui devi dire che c’e’ il livello di impiego macro nell’industria chimica e manifaturiera e quello dell’impiego in ofrma di film sottile nei fenomeni e applicazioni di superfice nei micro-dispositivi (come elettroliti e lubrificanti) Terrei separate nelle due meta’ destra e sinistra della slide le due cose Puoi mostrare immagini piu’ specifiche relative ad applicazioni specifiche appartenenti alle due categorie tratte dalle varie presentazioni dei miei precedenti studenti che trovi sulla intranet. Metti le ref ai nostri lavori precedenti(in generale metti qualche ref importante a sostegno di quel che dici) Il messaggio qui e’ che i liquidi ionici sono usati e studiati molto, ma che senza una valutazione della loro tossicita’ e sostenibilita’ ambientale non possono realmente affermarsi (questo lo specifichi nelle due slide successive) Questa slide andrebbe unita alla precedente

Valutazione della tossicità di una sostanza chimica Liquidi ionici Valutazione della tossicità di una sostanza chimica Bioaccumulazione Dispersione nell’ ambiente Questa slide e la successiva definiscono il problema che hai studiato e introducono la parte piu’ specifica Degradabilità ambientale Attività biologica

Liquidi ionici Attività biologica Distruzione delle membrane Catena laterale alchilica del catione Citotossicità Anione Catione Questa slide andrebbe unita alla precedente Qui devi anticipare i possibili meccanismi di interazione alla base della tossicita’, e quindi introdurrei qui la tipologia di ils utilizzati e porrei l’accento sul fatto che c’e’ una coda lipofilica che potenzialemnnente puo’ interagire con la membrana ecc... Fai vedere uno schema di un catione che si infila in un bilayer..... Deve essere chiro da subirto quale e’ il nocciolo del problema che hai affrontato, devi anticipare le cose, non farle apparire poco alla volta altrimenti non ti seguono Distruzione delle membrane cellulari a causa dell’ inserzione dei cationi di liquido ionico tra le molecole di fosfolipidi

Membrane biologiche – doppi strati fosfolipidici Cellula Fai vedere a questo proposito uno schema di una cellula dove si apprezzi il fato che la membrana e’ un bilayer di lipidi Devi far capire che il sistema reale e’ la cellula o l’organismo, e che tu hai studiato un modello sempificato Membrana cellulare

Membrane fosfolipidiche Esempio di un fosfolipide di membrana Membrana fosfolipidica supportata Questo lo metti come particolare della slide precedente Per rendere piu’ chiara l’esosizione puoi usare l’animazione «appear»

Strategia sperimentale L’ interazione tra membrane lipidiche e liquidi ionici permette di comprendere il tipo di tossicità di cui questi sono responsabili. Lo studio è stato condotto mediante l’ ausilio del microscopio a forza atomica. Il quale ha permesso di svolgere sul campione di lipidi due tipi di analisi : Analisi morfologica Analisi meccanica Questa slide serve per presentare la scaletta della presentazione da qui in poi e per introdurre quel che hai fatto e come lo hai fatto (analisi morfologica – e meccanica - in time-lapse per seguire l’interazione liquido-bilayer), e le motivazioni alla base (ovvero perche’ hai scelto di lavorare con i bilayer ecc, vedi sotto) Puoi sovrapporre all’imagine afm lo schema della sonda afm – cantilever con tip – in modo che sia chiaro che tu vai a investigare il sistema con una sonda locale (lo schema dell’afm lo mostri a fianco, vedio slide successiva) Puoi mettere delle frecce con delle etichette (substrato di mica, bilayer lipidico...) per rendere piu’ chiara l’immagine Devi dire in modo molto succinto che le membrane lip sono un MODELLO di membrane piu’ complesse, quelle di cellule e altri organismi viventi, rispetto ai quali si vuole comprendere la tossicita’ dei liquidi

Microscopio a forza atomica Principio di funzionamento Direi che devi inserire questa parte nella slide precedente, basta solo lo schema dell’afm, che introduci dicendo solo che e’ una tecnica microscopica che sfrutta una sonda nanometrica in scansione per fare sia imaging topografico che misure di forze di interazione e quindi anche misure meccaniche locali Il catalyst e’ di Bruker... Qui Prima di mostrare dettagli su afm devi fare un momento di riepilogo dicendo cosa hai fatto e perche’ in modo piu’ puntuale, in particolare stressa il fatto che hai voluto studiare meccanismi di interazione che avvengono tra nanostrutture – i bilayer – e i liauidi, e che hai quindi svolto studi locali in time lapse usando una strumeno che ti permettesse di farlo, poi passi all’afm... Quando introduci afm devi subito dire che lo usi grazie alla capacita’ di fare imaging ad alta risoluzione ma anche analisi nanomeccanica, ovvero controllare e misurare forze sulla scala del nN e risolvere spazialmente questa analisi Bioscope catalyst della Bruker instruments utilizzato durante il periodo di tesi

Preparazione delle membrane lipidiche modello Sonicatore Disco di mica Lipidi in soluzione Vortex Membrana lipidica all’ AFM Essicazione Formazione delle membrane Qui devi prima descrivere per punti il protocollo sperimentale, dividendolo in analisi morfologica time lapse e analisi meccanica. Poi cominci a descriverlo Il primo in questa slide step e’ una soluzione di fosfolipidi in opportuno solvente.... Flusso di azoto significa essiccazione del campione... Utilizza i termini corretti nella presentazione...

Preparazione delle membrane Mappa topografica del campione Scala cromatica nanometrica verticale della zona di scansione Scala nanometrica laterale della zona di scansione Togli questa slide, queste cose le spieghi velocemente nella precedente Substrato Bilayer lipidico Scala nanometrica longitudinale della zona di scansione

Analisi morfologica e meccanica in time-lapse - Procedura sperimentale Effetti distruttivi della misura I 5 liquidi ionici usati : [Bmim][BF4](idrofilo) [Bmim][NTf2](idrofobico) [Emim][NTf2] (idrofobico) [Omim][NTf2] (idrofobico) [C12mim][NTf2] (idrofobico) Quesa e’ la strategia sperimenale generale, seguiranno quelle specifiche per la parte morfologica e meccanica Per punti di’ cosa hai fatto Acquisizione mappe morfologiche stessa regione a tempi successivi prima e dopo aggiunta di IL Esecuzione di prove meccaniche risolte spazialmente su scala nano per misurare forza di rottura lista degli IL usati Indica i parametri tipici ( tipica risoluzione temporale delle misure, concentrazioni degli ils, ecc...) Ricordati di sottolineare le principali carateristiche di questi liquidi che hai usato, in relazione alla lipofilicita’ e alla catena alhilica ecc... Petri Provetta contenente soluzione contaminante di liquido ionico

Analisi morfologica del sistema strato lipidico-ILs Zona scansione :10μm x 10μm Concentrazioni: 0,01mM 0,1mM 1mM (tutti) 1mM 10mM 100mM [Bmim][BF4] 0,0001mM 0,001mM [C12mim][NTf2] Esempio di istogramma delle altezze Numero di conteggi Qui spieghi come fai l’analisi degli spessori e della frazione di ricoprimento Metti frecce e etichette per spiegare come misuri le altezze dagli istogrammi e anche per indicare che dal rapporto delle aree determini la frazione di ricoprime Devi anche mettere le unita’ di misura! nto Altezza Schermata del programma utilizzato per analizzare le mappe topografiche

Analisi morfologica Deposizione di micro-gocce di liquido ionico segregato Esperimento [Bmim][NTf2] a concentrazioni di 0,01mM e 0,1mM Concentrazione: 0mM Tempo: 5min Devi anticipare a voce che tipi di esperimenti mostrerai, altrimenti non si capisce la logica e quali siano i risultati principali

Analisi morfologica Deposizione di micro-gocce di liquido ionico segregato Esperimento [Bmim][NTf2] a concentrazioni di 0,01mM e 0,1mM Concentrazione: 0,01mM Tempo: 15min

Analisi morfologica Deposizione di micro-gocce di liquido ionico segregato Esperimento [Bmim][NTf2] a concentrazioni di 0,01mM e 0,1mM Concentrazione: 0,01mM Tempo: 40min

Analisi morfologica Deposizione di micro-gocce di liquido ionico segregato Esperimento [Bmim][NTf2] a concentrazioni di 0,01mM e 0,1mM Concentrazione: 0,1mM Tempo: 80min

Analisi morfologica Deposizione di micro-gocce di liquido ionico segregato Esperimento [Bmim][NTf2] a concentrazioni di 0,01mM e 0,1mM Grafico dell’ area del picco gaussiano riferito alla membrana normalizzato rispetto al valore iniziale Spiega bene che l’area e’ norm su ogni immagine

Crescita degli strati lipidici a seguito della contaminazione Analisi morfologica Crescita degli strati lipidici a seguito della contaminazione Esperimento con [Bmim][NTf2] a concentrazioni progressive di 1mM, 10mM e 100mM Concentrazione: 0mM Tempo: 4,5min Parla di interaz con il liquido, non di contaminazione Metti sempre ben in evidenza che il stai usando e che caratteristica ha nel tuo caso il parametro piu’ importante e’ il numero di carboni che e’ legato alla lipofilicita’, questo devi stressarlo anche all’inizio Metti sempre delle ref quando citi lavori e risultati

Analisi morfologica Concentrazione: 1mM Tempo: 36min Esperimento con [Bmim][NTf2] a concentrazioni progressive di 1mM , 10mM e 100mM Concentrazione: 1mM Tempo: 36min

Analisi morfologica Concentrazione: 10mM Tempo: 58,5min Esperimento con [Bmim][NTf2] a concentrazioni progressive di 1mM, 10mM e 100mM Concentrazione: 10mM Tempo: 58,5min

Analisi morfologica Concentrazione: 100mM Tempo: 90min Esperimento con [Bmim][NTf2] a concentrazioni progressive di 1mM, 10mM e 100mM Concentrazione: 100mM Tempo: 90min

Analisi morfologica Esperimento con [Bmim][NTf2] a concentrazioni progressive di 1mM , 10mM e 100mM

Analisi morfologica Interpretazione della crescita delle membrane Traccia della membrana originaria Interpretazione della crescita delle membrane Qui mancano delle etichette (prima – dopo? ) per poter capire cosa viene mostrato Le slide devono spiegarsi da sole, anche se tu ci parli sopra Nuova membrana rugosa

Analisi morfologica Concentrazione: 0mM Tempo: 4,5min [C12mim] [NTf2] a bassa concentrazione prima 0,0001mM successivamente 0,001mM Concentrazione: 0mM Tempo: 4,5min

Analisi morfologica Concentrazione: 0,001mM Tempo: 32,5min Formazione di piccoli buchi [C12mim] [NTf2] a bassa concentrazione prima 0,0001mM successivamente 0,001mM Concentrazione: 0,001mM Tempo: 32,5min

Analisi morfologica Concentrazione: 0,001mM Tempo: 41,5min I buchi vengono immediatamente richiusi [C12mim] [NTf2] a bassa concentrazione prima 0,0001mM successivamente 0,001mM Concentrazione: 0,001mM Tempo: 41,5min

Analisi morfologica Concentrazione: 0,001mM Tempo: 60min [C12mim] [NTf2] a bassa concentrazione prima 0,0001mM successivamente 0,001mM Concentrazione: 0,001mM Tempo: 60min Formazione di nuove membrane Le striature potrebbero essere state indotte dal movimento della sonda.. Che ha riorganizzato materiale staccatosi per effetto dell’interazione

Analisi morfologica Evoluzione temporale delle altezze spessori iniziali misurati 3,4 -6,5 nm grafico in funzione del tempo: Nuovo incremento Crescita iniziale A che sistema si riferisce Perche’ per i precedenti mostri solo l’andamento dell’area e non dello spessore ? Non dovresti riassumnere i risultati di area e spessore per tutti i liquidi studiati ? Decrescita

Analisi meccanica Concentrazione: 1mM [Bimim][BF4] Questa slide introduce la strategia sperimentale per le misure meccaniche, fa il pari con quella che introduce le misure morfologiche Fai vedere sovrapposta ala mappa topo la griglia di punti dove fai le misure di forza Line a distanza costante 2nm Linea a forza costante 0,5 nN

Analisi meccanica Confronto delle misurazioni di altezza prima e dopo esposizione 1mM [Bmim][ BF4] Mappe morfologiche ottenute dall’ analisi morfologica 0mM [Bmim][ BF4] 1mM [Bmim][ BF4]

Analisi meccanica Confronto delle misurazioni di altezza prima e dopo esposizione 1mM [Bmim][ BF4] Mappe morfologiche ottenute dalla spettroscopia di forza Unica slide con la precedente e con le forze di penetrazione, metti le mappe in una tabella 2x3 cosi’ e’ piu’ immediato il confronto 0mM [Bmim][ BF4] 1mM [Bmim][ BF4]

Analisi meccanica Confronto delle misurazioni di altezza prima e dopo esposizione 1mM [Bmim][ BF4] Tabella riassuntiva: Peak force tapping 0mM [Bmim][ BF4] Peak fore tapping 1mM Spettroscopia di forza 0mM Spettroscopia di forza 1mM   3,48 ± 0,07 nm 2,85 ± 0,06 nm 3,23 ± 0,09 nm 2,98 ± 0,08 nm L’errore mi convince poco, e troppo piccolo, metti 0.1 nm e lascia una sola cifra decimanle

Analisi meccanica Confronto forze di penetrazione prima e dopo esposizione 1mM [Bmim][ BF4] Mappe forza di penetrazione Qui devi fare un break e mettere qui la spiega di come fai l’analisi meccanica e come tiri fuori i vari parametri e introduci cosa farai vedere. Devi stressare molto il fatto che puoi fare mappe, ovvero risovere spazialmente l’analisi nanomeccanica Io farei vedere tutto l’array topografia, forza di penetrazione - spessore 0mM [Bmim][ BF4] 1mM [Bmim][ BF4]

Analisi meccanica Confronto forze di penetrazione prima e dopo esposizione 1mM [Bmim][ BF4] Tabella riassuntiva: 0mM [Bmim][ BF4] 1mM [Bmim][ BF4] 2,49 ± 0,06 nN 1,77± 0,04 nN Confronto fra le curve di forza Questo grafico lo puoi espandere tagliando la parte a grandi separazioni che non e’ importante Lascia una sola cifra decimale

Conclusioni Prospettive L’ osservazione dell’ interazione tra liquidi ionici e membrane lipidiche ha evidenziato: Effetti di segregazione Variazioni morfologiche del campione Variazioni meccaniche Prospettive Misurazione di nuove grandezze meccaniche Miglioramento delle tecniche di osservazione della cinetica di reazione Ripetizione delle misure di spettroscopia su substrati coperti da strati di polimero Hai poi messo lo studio della cinetica su scale di tempo dilatate? Questo e’ importante per le conclusioni, ovvero mostrare che i tuoi epserimenti hanno mostrato come la cinetica sia rapida (fornisci un limite superiore) e come si debba fare per poterla seguire meglio... Cerca adesso di passare dalla fase di bozza ad avere una cosa in forma semidef ancorche’ da limare Devi parlare meno di 15 minuti