TECNICHE CENTRIFUGATIVE PRINCIPI DI BASE DELLA SEDIMENTAZIONE TIPI DI CENTRIFUGHE ULTRACENTRIFUGA ANALITICA

TIPI DI CENTRIFUGHE CENTRIFUGHE PREPARATIVE Consentono la separazione, isolamento e purificazione di cellule intere, organi subcellulari membrane plasmatiche, ribosomi, acidi nucleici e proteine a partire da vari tipi di tessuti... da utilizzare in successive analisi biochimiche. CENTRIFUGHE ANALITICHE Permettono di studiare le caratteristiche di sedimentazione di macromolecole pure: grado di purezza, forma, massa relativa. Utilizzano minime quantità di materiale, e rotori opportunamente progettati allo scopo di seguire in continuo il processo di sedimentazione del materiale sottoposto a campo centrifugo.

PRINCIPI GENERALI DELLA SEDIMENTAZIONE Se una soluzione viene lasciata in condizione di quiete le particelle che la compongono tendono a sedimentare per la forza di gravità. La velocità di sedimentazione è proporzionale alla forza applicata: Lo scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione è quello di aumentare la velocità di sedimentazione delle particelle esercitando una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre

CENTRIFUGAZIONE Una centrifuga è usata per separare particelle subcellulari e in alcuni casi macromolecole in base a: dimensione densità forma Metodo: Viene sfruttata la differenza di densità tra le particelle ed il mezzo in cui sono sospese Alla sospensione viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (campo centrifugo).

IL CAMPO CENTRIFUGO G = 2 r  = 2 π rpm/60 G = 4 π2 (rpm)2 r/3600 La velocità di sedimentazione dipende dl campo centrifugo applicato Il campo centrifugo applicato (G) è proporzionale al quadrato della velocità angolare del rotore ( espressa in rad s-1) ed alla distanza radiale della particella dall’asse di rotazione (r espressa in cm): G = 2 r una rivoluzione del rotore è uguale a 2p radianti  = 2 π rpm/60 rpm=rivoluzioni al minuto Il campo centrifugo in rpm è: G = 4 π2 (rpm)2 r/3600

IL CAMPO CENTRIFUGO RELATIVO Spesso il campo centrifugo viene espresso come multiplo del campo gravitazionale terrestre (981 cm s-2), cioè come il rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della medesima sottoposta alla sola forza di gravità Campo centrifugo relativo (RCF) (numero di g) RCF = 4 π2 (rpm)2 r/3600·981= (1.118·10-5) (rpm)2 r

VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE La velocità di sedimentazione di una particella dipende oltre che dal campo centrifugo applicato anche dalla massa della particella, dalla densità e viscosità del solvente in cui avviene la sedimentazione, dalla forma della particella. La forza verso l’esterno a cui viene sottoposta la particella è: rp = densità della particella rm = densità del mezzo F = 4/3 π rp3 (rp - rm) 2 r forza d’attrito F0= v f v = velocità di sedimentazione f = coefficiente d’attrito = 6πηrp (eq. di Stokes) η = viscosità del mezzo

VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE Una particella sferica non idratata, sottoposta ad un campo centrifugo, accelera fino a che la forza di sedimentazione non diventa uguale alla forza d’attrito che oppone resistenza al movimento nel mezzo F = F0 4/3 π rp3 (rp - rm) 2 r = 6πηrpv v = dr/dt = 2 rp2 (rp - rm) 2 r /9η La velocità di sedimentazione è proporzionale alle dimensioni della particella. Si azzera quando la densità della particella e quella del mezzo si equivalgono.

TEMPO DI SEDIMENTAZIONE Integrando l’equazione precedente: t = 9η/ 2 2 rp2 (rp - rm) ln (rb/rt) rt= distanza radiale dall’asse di rotazione al menisco rb = distanza radiale dall’asse di rotazione a fondo della provetta Giocando sul tempo e sul livello di sedimentazione si separano macromolecole biologiche e organelli sub-cellulari a partire da tessuti

v = dr/dt = 2 rp2 (rp - rm) 2 r /(9η f/f0) Il rapporto d’attrito v = dr/dt = 2 rp2 (rp - rm) 2 r /(9η f/f0) f = coefficiente di attrito di una particella non sferica e/o idratata f0 = coefficiente di attrito teorico di una particella sferica non idratata f/f0 rapporto d’attrito tiene conto della forma della particella, e dell’idratazione Per proteine globulari va da 1 a 1.4 Dipende dalla forma (superficie esposta al solvente, folding)

IL PRINCIPIO DELLA SEDIMENTAZIONE

COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE La velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo è detta coefficiente di sedimentazione s = v / 2 r = 2 rp2 (rp - rm) /9η L’unità usata per le particelle biologiche è lo Svedberg (S)=10-13 s

TIPI DI CENTRIFUGHE centrifughe da banco (4000-6000 rpm, RCF = 3000-7000 g) centrifughe refrigerate a grande capacità (100 ml) (6000 rpm, 6500 g) centrifughe refrigerate ad alta velocità (15 ml) (25000 rpm, 60000 g) ultracentrifughe preparative (80000 rpm, 600000 g) la camera è refrigerata, sigillata e sotto vuoto, per minimizzare aumenti di temperatura generati dall’attrito con l’aria. Le provette devono essere perfettamente bilanciate (scarto 0.1 g) ultracentrifughe analitiche (70000 rpm, 500000 g) la camera è blindata, refrigerata, sottovuoto. Sistema ottico per consentire di osservare il materiale che va sedimentandosi durante la centrifugazione

ULTRACENTRIFUGA ANALITICA Il sistema ottico di Schlieren misura la variazione di indice di rifrazione presente in ogni punto della cella ad intervalli di tempo variabili Vcella da 0.4 a 1.0 ml Diluizione radiale si abbassa l’altezza del picco ma l’area è costante

TIPI DI ROTORI 2 r ROTORI A BRACCI OSCILLANTI Il campo è proporzionale a 2 r Le particelle sono sottoposte ad un campo sempre più intenso via via che si allontanano dall’asse di rotazione Raggio medio di rotazione rav è La media aritmetica tra rmin e rmax

TIPI DI ROTORI ROTORI AD ANGOLO FISSO Durante l’accelerazione del rotore si verifica un riorientamento del campione, la separazione avviene durante la centrifugazione. Quando il rotore è fermo il gradiente si ridistribuisce

TIPI DI ROTORI ROTORI AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE RIORIENTAMENTO DEL CAMPIONE

TIPI DI ROTORI ROTORI ELUTRIATORI Rotore a flusso continuo Contiene una nicchia che accoglie una camera di separazione. Le particelle, sospese in un mezzo uniforme a bassa densità, vengono pompate nella camera del rotore. La forma conica della camera di separazione fa sì che in essa si formi un gradiente di velocità di flusso, opposto al campo centrifugo applicato Velocità di sedimentazione controbilanciata dalla velocità di flusso: Le particelle più grandi si accumulano verso l’estremità centrifuga della camera

ESEMPIO. SEPARAZIONE DI FRAZIONI SUB-CELLULARI