Flusso dell’informazione genetica

Trascrizione dell’RNA (1) Topoisomerasi La trascrizione è catalizzata dalla “RNA polimerasi diretta dal DNA” con un meccanismo molto simile alla DNA polimerasi Differenze con la DNA polimerasi:  non ha bisogno del primer  non ha una efficace attività di proofreading

Trascrizione dell’RNA (2) Per convenzione la sequenza di riferimento utilizzata per indicare una gene è quella non-stampo (detta impropriamente codificante). In realtà la catena che codifica per l’RNA è quella che va in direzione 5’→3’ In alcuni virus (es: adenovirus) entrambe la catene codificano proteine

Trascrizione dell’RNA (3) Il corretto posizionamento dalla RNA polimerasi sulla catena stampo è guidato da specifiche “sequenze consenso” denominate “promotori” Promotori procariotici Promotori eucariotici

Trascrizione dell’RNA nei procarioti (1) Le fasi della trascrizione (E. coli) Fase di legame Interazione RNA polimerasi con il promotore (complesso chiuso) Svolgimento del DNA da -10 a + 3 o +5 (complesso aperto) Fase di inizio Inizio della trascrizione; dopo 8-9 nucleotidi sintetizzati viene rilasciata la subunità sigma (s) . Prosecuzione della sintesi dell’RNA Il sito di inizio della trascrizione è finemente regolato ( vedi lac operon)

Trascrizione dell’RNA nei procarioti (2) Fase di terminazione r-indipendente  Formazione nella regione terminale di un ibrido DNA-RNA instabile per la presenza di molte coppie A=U Formazione di una struttura a “forcina” per la presenza di nucleotidi complementari che destabilizzano definitivamente l’ibrido DNA-RNA con conseguente rilascio dell’mRNA trascritto r-dipendente Presenza di una proteina r con attività elicasica che promuove il distacco dell’ RNA dal DNA

Trascrizione dell’RNA negli eucarioti La trascrizione negli eucarioti è molto complessa e ancora non ben chiarita Tre RNA polimerasi RNA polimerasi I (Pol I): sintesi pre-rRNA RNA polimerasi II (Pol II): sintesi mRNA 12 subunità 6 fattori di inizio 4 fattori di allungamento RNA polimerasi III (Pol III): sintesi tRNA, rRNA 5S

Inibitori della trascrizione L’actinomicina D e l’acridinasono due antibiotici che agiscono sia nei batteri che negli eucarioti. La parte colorata planare si lega tra due successivi appaiamenti G≡C del DNA provocando una deformazione che non permette dalla RNA polimerasi di trascrivere. La rinfamicina si lega alla RNA polimerasi batterica impedendo la trascrizione(antibatterico) L’a-amanitina , presente nel fungo Amanita phalloides, inibisce fortemente la Pol II causando la morte degli organismi animali.

Trascrizione procarioti & eucarioti (1)

Trascrizione procarioti & eucarioti (2) mRNA procariotico Prevalentemente policistronico mRNA eucariotico Prevalentemente monocistronico

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (1)

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (2) “Incappucciamento” dell’mRNA

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (3) Poliadenilazione (inserimento della “coda”) Formazione del legame tra la sequenza segnale (AAUAAA) e il complesso enzimatico Scissione in una posizione tra 11 a 30 nucleotidi da AAUAAA Sintesi della coda poli(A) lunga da 80 a 250 nucleotidi

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (4)

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (5)

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (6)

Modificazioni post-trascrizionali del rRNA

Modificazioni post-trascrizionali del tRNA

Attività catalitica dell’RNA (Ribozimi) L’esistenza di RNA catalitici e l’interconversione di RNA a DNA (vedi retrovirus con trascrittasi inversa) hanno portato all’ipotesi che la prima fase dell’evoluzione biologica sia stata la comparsa dell’RNA (o di un polimero equivalente) in grado di catalizzare la sua stessa replicazione Bibliografia: Bittker,J.A., et. al. Curr. Opin.Chem.Biol. 6, 367-374 (2002) Johston, W.K, et al. Science, 292, 1319-1325 (2001) Joyce, G. E. Nature, 418,214-221 (2002) Wilson, D.S. et al. Annu.Rev.Biochem. 68,611-648 (1999) Yarus, M. Ann. Rev. Genet, 36, 125-151 (2002)

Sintesi RNA e DNA, dipendente dall’RNA Espansione del dogma centrale della biologia per includere la sintesi RNA-dipendente di RNA e DNA

Retrovirus & trascrittasi inversa (1) I retrovirus hanno una DNA polimerasi dipendente dall’RNA (“trascrittasi inversa”) che produce DNA a partire dal loro RNA RNA virale trascrittasi inversa Ibrido RNA-DNA trascrittasi inversa cDNA (DNA complementare) integrasi Integrazione nel DNA della cellula ospite

Retrovirus & trascrittasi inversa (2) Le trascrittasi inverse non hanno attività esonucleasica 3’→5’ con funzione “proofreading” Ciò comporta una frequenza di errore di 1 ogni 20.000 nucleotidi aggiunti con conseguente continua mutazione del virus Le trascrittasi inverse sono diventate importanti nel clonaggio molecolare in quanto rendono possibile la sintesi in laboratorio a partire dall’RNA (DNA complementare, cDNA)

Gene in origine presente nella cellula ospite, codificante Retrovirus & cancro Genoma del sarcoma di Rous (o aviario) per una tirosina chinasi coinvolta nei processi di normale divisione cellulare (pro-oncogene) Gene in origine presente nella cellula ospite, codificante In seguito a ricombinazione con il genoma di un retrovirus e successive mutazioni, si possono generare degli oncogeni (evento raro) codificanti per proteine che provocano una incontrollata riproduzione cellulare (tumore)

Retrovirus & AIDS Genoma dell’HIV “geni sovrapposti” Piccolo genoma (9,7x10-6 nucleotidi) che grazie a meccanismi di “splicing alternativo” causano la produzione di molte proteine diverse

Analogo Chemioterapia con analoghi purinici e pirimidinici L’analogo viene somministrato come base libera o nucleoside (pro-farmaco) perche il nucleotide farmacologicamente attivo essendo carico non riesce ad attraversare la membrana biologica Analogo

Azione farmacologica dell’AZT RNA DNA CTP UTP dCTP dUTP dTTP dAZTTP CDP UDP dCDP dUDP dTDP dAZTDP de novo CMP UMP dCMP dUMP dTMP dAZTMP H2O NH3 H2O NH3 CR UR CdR UdR TdR AZTdR U T Membrana cellulare ● O HO-CH2 H Timina N=N=N ⊕ ⊖ AZT 3’-azido-2’,3’-dideossi-timidina (AZT)