APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE Prof. Elisa Prearo LST 2007/2008

Biotecnologie: definizione Per biotecnologia si intende l’insieme dei prodotti industriali che si ottengono per mezzo di processi in cui sono coinvolti organismi o sistemi biologici Utilizza le tecniche del DNA ricombinante

Perche’ Produzione di proteine utili Insulina Somatostatina Rennina Cellulasi Produzione di vaccini per le malattie virali

Trasferimento di geni tra cellule eucariote Lo scopo è quello di sostituire dei geni “cattivi” con i geni “buoni” oppure per migliorare le “prestazioni” di una specie Complesso: devono essere incorporati nei cromosomi, introdotti in molte cellule, regolati Esperimenti riusciti con i topi: il gene della β-globina di coniglio Introdotta nelle uova con un plasmide è stata inglobata nel genoma al posto giusto ed espressa, topo con la βglobina di coniglio e trasmessa con distribuzione mendeliana

Applicazioni delle biotecnologie Clonazione OGM Cellule staminali Terapia genica Bioremediation

Clonazione La clonazione in senso stretto è una tecnica che permette di riprodurre identicamente un frammento di DNA utilizzando la cellula batterica. Se si parla di organismi eucarioti pluricellulari è’ una tecnica in cui il nucleo proveniente dalla cellula di un donatore viene trapiantato in una cellula uovo ospite , viene fatta normalmente sviluppare fino allo stadio adulto in modo da ottenere la generazione di soggetti a corredo genetico identico. Ottenere una serie di individui adulti 2n senza la fusione di due gameti. Vegetali: si parte da una cellula del corpo della pianta Animali: si opera su embrioni molto precoci: splitting

Lo Splitting In genere lo fanno alcuni allevatori per ottenere più esemplari di bestiame pregiato Suddividere un embrione molto precoce (che non abbia più di otto cellule) in due, quattro o otto cellule e ottenere altrettanti embrioni geneticamente uguali fra loro. i singoli embrioni, dopo essere stati suddivisi, vengono poi inseriti nell'utero di madri che porteranno a termine la gravidanza Cloni a scopo di ricerca  Cloni ad alto valore commerciale  Cloni di specie a rischio  Cloni produttori di proteine umane Cloni per xenotrapianti 

Esperimento di Gurdon che dimostra come ciascuna cellula somatica di un organismo contenga tutti i geni per codificare l’intero organismo

Dolly La pecora Dolly (5 luglio 1996 - 14 febbraio 2003) è il primo mammifero ad essere stato clonato con successo da una cellula adulta. E’ stata creata al Roslin Institute in Scozia (Edinburgo) da Ian Wilmut, dove ha vissuto fino alla morte. Gli scienziati annunciarono la sua nascita solo l'anno successivo (22 febbraio 1997). La tecnica usata è un trasferimento nucleare in cellule somatiche. I nuclei di cellule non riproduttive del donatore sono state trasferite in cellule embrionali denucleate e quindi indotte ad avviare lo sviluppo del feto. Quando Dolly è stata clonata, è diventata il centro di una controversia che continua ancora oggi. Il 9 aprile 2003 i suoi resti impagliati sono stati posti al Royal Museum di Edinburgo, che fa parte del National Museum di Scozia.

Keith Campbell: fu questo biotecnico (oggi passato all’università di Nottingham) ad avere l’idea di coordinare il ciclo vitale delle cellule riceventi e private del nucleo con quello delle cellule donatrici, il cui materiale genetico era destinato ad essere clonato. prima di ottenere un embrione vitale (Dolly appunto) sono andati male ben 430 tentativi: cosa da segnalare, visto che il gruppo di Wilmut ha dichiarato apertamente di voler arrivare alla clonazione di un essere umano. Dolly ha poi dovuto essere liquidata per «eutanasia», dato che presentava gravi disturbi, fra cui l’invecchiamento precoce. Questo perché la cellula somatica denucleata proveniva da un’esemplare dell’età di 6 anni. Paradossalmente il patrimonio genetico di Dolly, alla nascita, era già vecchio di 6 anni.

K. H. S. Campbell e I. Wilmut, hanno concluso un esperimento ancora più delicato, ottenendo due pecore identiche che, all'età di sette mesi, nel marzo del '96 sono finite sui giornali di mezzo mondo: Megan e Morgan, due esemplari identici come gemelli monovulari.

OGM OGM

Cosa sono gli OGM La sigla OGM significa organismi geneticamente modificati. Gli organismi possono essere modificati geneticamente attraverso metodi “classici” da sempre usati nelle pratiche agricole quali: Reincrocio ricorrente per ottenere individui con caratteristiche di interesse Mutagenesi Ibridazione tra specie diverse

TRASFORMAZIONE Un plasmide contenente DNA esogeno può essere usato per infettare una cellula batterica o eucariotica. Questa cellula può integrare il DNA esogeno con il DNA nucleare e venire quindi TRASFORMATA

PLASMIDE TI di Agrobacterium tumefaciens Tumor Inductor Lungo circa 200 kb Esso contiene una regione trasformante detta T-DNA che può essere excisa e trasferita. Essa è lunga 30 Kb

inserire un frammento di DNA esogeno. La cellula vegetale integra la T-DNA e acquista tutti i geni che essa contiene. Nella regione T-DNA è possibile inserire un frammento di DNA esogeno. Si introduce un gene di interesse nel plasmide TI ( nella T-DNA ) Si incubano batteri A.tumefaciens con il plasmide Ti modificato Si infettano cellule vegetali con il batterio A.tumefaciens

Perchè gli OGM La popolazione mondiale aumenta, mentre la terra coltivabile diminuisce a causa delle crescenti siccità, salinità, urbanizzazione. Dopo il 2030 si ipotizza che tutta la superficie coltivabile non sarà più in grado di produrre sufficiente cibo Ogni terreno coltivabile dovrà produrre il doppio di oggi, nel rispetto dell’ambiente e con minor ausilio della chimica (insetticidi, diserbanti, fungicidi, fertilizzanti, fitofarmaci). Gli OGM non sono la soluzione definitiva ma sono essenziali per affrontare il problema

Le coltivazioni GM più diffuse Mais Soia Colza Pomodori Cotone Riso Tabacco Patate Pomodoro transgenico arricchito in β -carotene Pomodoro “selvatico”

Alcune caratteristiche Attività insetticida Resistenza a erbicidi Tolleranza a stress ambientali Vita più lunga o maturazione ritardata Migliori qualità nutrizionali (nutraceutics) Allungamento dei tempi di conservazione

Interventi sull’ambiente Indiretti Miglior utilizzazione dei suoli Riduzione impatto ambientale Diretti Disinquinamento suoli e acque (Arabidopsis thaliana ) Riforestazione Protezione specie a rischio

Lotta biotecnologica insetticida contro i parassiti

Il mais brevettato dalla Novartis contiene un gene del Bacillus thuringiensis (Bt) che produce la proteina (Cry Protein) che cristallizza nell’intestino delle larve di piralide provocandone la morte, ma innocua per l’uomo e per molti insetti utili.

Esistono diversi "geni Bt" in grado di sintetizzare diverse proteine insetticide e con diversi meccanismi di azione legati al diverso gene promotore responsabile della produzione della proteina insetticida. Ci sono quattro diversi "eventi" Bt ad uso commerciale: 176 - denominato Knockout da Novartis Seeds e NatureGard da Mycogen Seeds (espresso solo nei tessuti verdi e nel polline) Bt 11 - denominato Yieldgard da NK Novartis Seeds Mon 810 - denominato Yieldgard da Monsanto (non contiene marcatori) DBT 418 - denominato Bt-Xtra da Dekalb. Non tutti i geni Bt sono uguali ma differiscono per modalita' di espressione e livello di protezione della pianta.

Grafico 1: produzione (q. li/ha al 15 Grafico 1: produzione (q.li/ha al 15.5 % umidita') dei migliori ibridi Bt a confronto con i migliori ibridi "normali" nelle localita' di Lonigo (VI) e Ceregnano (RO) Grafico 2: Valutazione visiva dei sintomi dell'attacco di piralide alla spiga e numero e lunghezza delle gallerie (cm) per i diversi eventi in prova (176, Mon 810 e Bt11 (5= massima gravita' dell'attacco; 0= assenza dei sintomi).

Vantaggi del mais Bt aumento delle rese mediamente quantificabili nell'ordine del 10 % una maggiore "stabilita’" e stay green della pianta in campo una minore incidenza di malattie fungine alla spiga.

Rischi ecologici Soluzione esiste il pericolo di selezionare piralidi resistenti o quantomeno piu’ tolleranti alle proteine Bt prodotte dalla pianta Soluzione creazione di "zone rifugio" di mais normale nello stesso appezzamento o in campi adiacenti al mais Bt, in cui la piralide puo' liberamente incrociarsi .

Farfalla monarca: il 20% in meno delle larve esposte al polline di mais Bt raggiunge l'età adulta. Se si usano i pesticidi, una percentuale molto maggiore di larve di farfalla monarca non raggiunge l’età adulta; ma non solo farfalle, anche molte altre specie di insetti vengono sterminate

Migliori qualità nutrizionali: Golden Rice basmati japonica

Il riso è l’unica fonte di cibo per molte popolazioni, soprattutto asiatiche, ma manca della provitamina A (β -carotene) La sua carenza porta a cecità e immunodeficienze Sono stati introdotti geni in modo che venga espresso il β -carotene nell’endosperma dei semi. Vantaggi: la provitamina A è espressa nel riso quindi anche alimentandosi di solo riso si garantisce l’apporto di ß-carotene nella dieta Obiezioni: la quantità di β -carotene è comunque poca.

GREENPEACE Facendo affidamento solo sul Golden Rice, un adulto dovrebbe mangiare almeno 9 Kg di riso cotto, per soddisfare il bisogno quotidiano di β -carotene. In altre parole, consumare quotidianamente 300 grammi di riso coprirebbe solo l'8% della richiesta fisiologica giornaliera di β -carotene. Una donna in allattamento dovrebbe mangiare addirittura 16 Kg di riso cotto al giorno!

Vantaggi per l’ambiente La coltivazione del cotone Bt negli USA (1 milione di ettari) consente di ridurre l’uso di pesticidi di 450 tonnellate all’anno

Rischi per la salute Possibilità di sviluppare allergie se i geni trasposti provengono da un alimento “allergizzante” (soia più ricca di metionina con un gene proveniente dalla noce brasiliana) o da organismi non abitualmente consumati (petunie, Golden Rice) Resistenza agli antibiotici se viene introdotto un gene di resistenza ad un antibiotico come "marcatore“. Permette di identificare le cellule in cui è riuscito il "trapianto" dei geni e successivamente non svolge più alcuna funzione.

Soja Noce brasiliana Trasferimento geni RISCHIO ALLERGIE

Risposte La ricerca può sostituire il gene allergizzante con quello presente in un’altra specie non allergizzante, inoltre è stata sviluppata una soia priva di una proteina che provoca allergie I microbiologi ritengono che sia improbabile il trasferimento della resistenza; inoltre sono state sviluppate nuove tecnologie di selezione delle piante transgeniche che non comportano l’impiego di marcatori con resistenza agli antibiotici. Dal 2004, secondo la vigente legislazione europea, nei Paesi aderenti all’UE non possono essere coltivate piante OGM recanti geni di resistenza ad antibiotici come marcatori.

Brevetti….. Con “brevetto biotecnologico” si intende la protezione commerciale per lo sfruttamento esclusivo sia di un ogm che dei suoi discendenti, ma anche delle tecniche usate per ottenerlo e riprodurlo nonché dei geni utilizzati per ottenere il nuovo organismo Attualmente sono tre i tipi di “bioinvenzione” che devono essere esclusi dalla brevettabilità: IL CORPO UMANO E I SUOI ELEMENTI MANIPOLAZIONE DEL GENE UMANO A FINI NON TERAPEUTICI PROCEDIMENTI DI MODIFICAZIONE DELL'IDENTITÀ' GENETICA DEGLI ANIMALI

….e legislazione Normativa internazionale: Normativa europea: la Convenzione di Rio sulla tutela della biodiversità Protocollo sulla biosicurezza Normativa europea: l’applicazione del Principio di precauzione prevede verifiche e controlli più accurati rispetto agli altri alimenti su due livelli: europeo e del singolo paese appartenente all’UE devono avere le stesse caratteristiche nutrizionali dei tradizionali Test di allergenicità etichettatura Normativa italiana: Gli Ogm devono essere controllati dal Ministero della Sanità Vige il divieto di coltivare transgenico Legislazione regionale “OGM-free”

Batteri, piante, nuove razze di animali ottenuti con l’ingegneria genetica possono venire brevettati... tuttavia, è etico brevettare organismi viventi? Il dibattito non è ancora concluso. C’è la possibilità di brevettare nuove forme di vita o loro parti. In questo modo, gli istituti e le industrie che, dopo aver speso cifre considerevoli per la ricerca, riescono a creare OGM, possono garantirsene in esclusiva la proprietà e lo sfruttamento economico dell’invenzione (perché di invenzione si tratta) almeno per un certo numero di anni.

Dopo tale termine, l'invenzione diviene di pubblico dominio e chiunque altro può farne uso. Tale possibilità certamente incoraggia la sperimentazione e per conseguenza aiuta la scienza a progredire.

La vita, di per sé, non può essere brevettata; invece possono venire brevettate le modifiche effettuate con l’ingegneria genetica sulle cellule viventi. Purché tali modifiche rappresentino un’invenzione con caratteristiche di novità e con possibilità di utilizzazione produttiva. Dunque, un gene, o meglio, una particolare sequenza di acidi nucleici in esso compresa, possono essere brevettati solo se l’inventore non ha semplicemente scoperto quanto avviene in natura, ma ha saputo isolare e riprodurre la struttura e la funzione delle sequenze di acidi nucleici necessari allo sviluppo di nuovi processi o prodotti.

Brevetti agro-biotech Università e centri di ricerca USA 20.5% 19.2 9.3 7.8 5.9