Esempi di modelli cinetici

1 Gating dei canali: modello a due stati  Mean open time (MOT) = 1/kc ko kc O 1 Gating dei canali: modello a due stati Mean open time (MOT) = 1/kc Mean closed time (MCT) = 1/ko Inoltre, allo stato stazionario: dPO/dt = ko - (ko + kc)Po = 0  Po = ko/(ko + kc)

Gating dei canali: Simulazioni di 2 Stati Cinetica lenta: ko=0.5/ms kc=0.5/ms Cinetica rapida: ko=5/ms kc=5/ms 4 3 2 1 Tempo (ms) 4 3 2 1 Tempo (ms) Significato di ko: Per ogni ms che il canale è nello stato chiuso, esso in media si aprirà 0.5 volte. Significato di kc: Per ogni ms che il canale è nello stato aperto, esso in media si chiuderà 0.5 volte. All of these simulations are based on the channels being closed at time 0. Then, there is some perturbation that brings about a new distribution between closed and open channels. The blue simulation is for channels that gate slowly. Note the wide variation in open duration. Some channels stay open for less than 1 ms, others open for several ms. The superposition is obtained by adding the currents, time point by time point, for 10 channels and taking the average. This simulates the behavior of multi-channel preparations. The red simulation mimics channels whose gate opens and closes very quickly. The traces certainly look busier. Compare the 2 superpositions. Both end up at the same level, near 50%, but the red one gets there more quickly. Significato di ko: Per ogni ms che il canale è nello stato chiuso, esso in media si aprirà 5 volte Significato di kc: Per ogni ms che il canale è nello stato aperto, esso in media si chiuderà 5 volte. 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Open Prob 4 3 2 1 Tempo (ms) Po=0.5 Po=0.5

Gating dei canali: Altre simulazioni a due stati Alta Po: ko=5/ms kc=0.5/ms 4 3 2 1 Tempo (ms) Bassa Po: ko=0.5/ms kc=5/ms 4 3 2 1 Tempo (ms) Now we examine two cases where the opening and closing rates are different from each other. In the red example, the opening rate is higher than the closing rate. See how high the open probability gets. In the blue example, the situation is reversed. The open probability stays low for the whole time. 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Open Prob 4 3 2 1 Tempo (ms) Po=0.9 Po=0.1

Esercizi sul Gating Predizioni k Tempo medio di chiusura 1 = Popen stato staz. = o k k + o k o c Tempo medio di apertura 1 Costante di tempo dell’attivazione 1 = = k k + k c o c Predizioni tempo medio di chiusura tempo medio di apertura costante di tempo (ms) These equations come from an analytical analysis of the 2 state model. The average lifetime of a state is inversely proportional to the rate for leaving the state. The steady state open probability increases with the opening rate, but cannot exceed 1.0. The onset time depends on BOTH opening and closing rates. When one rate is much larger than the other, that one dominates. Po esempio k (1/ms) k (1/ms) (ms) (ms) o c 1 0.5 0.5 2.0 2.0 0.5 1.0 2 5.0 5.0 3 5.0 0.5 4 0.5 5.0

Canale K+ 10 ms Depolarizz. Livelli energetici O C C O 100 Costanti di velocità C O C O 100 1 +50 mV Voltaggio -100 mV Corrente attraverso singoli canali Corrente attraverso molti canali 10 ms

Gating dei canali: Modello a 3 Stati con inattivazione 2 Gating dei canali: Modello a 3 Stati con inattivazione C O k+i k-i I ko kc Si applica a canali V-dipendenti inattivanti It’s getting more complicated now. But, that’s the way it is in nature!

Gating dei Canali: correnti medie con 3 Stati e inattivazione k+i k-i I ko kc 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Open Prob 50 40 30 20 10 tempo (ms) P open In the red superposition, you can see how the 3 state model can give rise to inactivation behavior. For the blue simulation, we set the inactivation rates to zero. This would be equivalent to the 2 state model. ko = 0.5/ms kc =0.005/ms k+i = 0.25/ms k-i = 0.025/ms k+i = 0/ms k-i = 0/ms

Relazioni tra costanti di velocità e costanti di tempo in un modello a tre stati con inattivazione ko k+i C O I k-i kc MOT = 1/(kc+k+i) MCT = 1/ ko MIT =1/k-i (tempo medio dello stato inattivato) MOB*=(kC/ k+i)+1 (numero medio di aperture/burst) Regola generale: il tempo medio che il canale trascorre in uno stato è uguale all’inverso della somma delle costanti di velocità che si allontanano da quello stato * Qualora il flikering sia tra C e O; altrimenti, se fosse tra O e I allora sarebbe: MOB=(k+i/ kC)+1

Diversi gradi di inattivazione C O k+i k-i I ko kc ko = 0.5/ms kc =0.005/ms k+i = 0.25/ms k -i = 0.025/ms ko = 0.5/ms kc =0.005/ms K +i = 0.25/ms k-i = 0.1/ms ko = 0.5/ms kc =0.005/ms K +i = 0.25/ms k -i = 0.25/ms All’aumentare di k-i diminuisce il grado di inattivazione

Canale del Na+ 1 ms Depolarizz. C Livelli energetici O O I I C 2 1000 2000 1000 Costanti di velocità C O I C O I 20000 10 20 10 +10 mV Voltaggio -100 mV Corrente attraverso singoli canali Corrente attraverso molti canali 1 ms

Aldrich, Corey, Stevens Nature (1983) Che informazioni possono darci registrazioni di singolo canale circa il gating che già non abbiamo appreso dallo studio delle correnti macroscopiche? Seguirà una reinterpretazione del gating del canale del Na+ VD basata su registrazioni di singolo canale. Aldrich, Corey, Stevens Nature (1983)

Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni “A reinterpretation of mammalian sodium channel gating based on single channel recording” Aldrich, Corey & Stevens – NATURE (1983) Modello di H. & H. Attivazione rapida Inattivazione lenta (e volt.dip.) Modello alternativo Attivazione lenta Inattivazione rapida (e volt.indip.) -100 +10 -100 +10 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50

Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni Modello di H. & H. Attivazione rapida Inattivazione lenta (e volt.dip.) Modello alternativo Attivazione lenta Inattivazione rapida (e volt.indip.) -100 +10 -100 +10 L’analisi della latenza permette di discriminare tra i due modelli l=2 ms l=10 ms C 400 20 O 100 I C 100 20 O 800 I

3 Gating dei canali: Modello a 3 Stati Un semplice schema di blocco Si applica a bloccanti del canale aperto canale non bloccato canale bloccato C O +B burst burst C a b O k+B·[B] k-B B Ricordarsi che la transizione O → B è data da k+B · [B], dove [B] è la concentrazione del bloccante. u.d.m.: k+B · [B] (s-1), [B] (M)  k+B (M-1·s-1) Mean open time (MOT) = 1/(b + k+B · [B]) Mean closed time tra i bursts (MCT) = 1/a Mean closed time all’interno dei bursts (MBT) = 1/k-B Mean opening per burst (MOB)=(k+B· [B]/b)+1

Effetto della concentrazione del bloccante k+B·[B] k-B B Ricavabile dall’analisi dei tempi medi di apertura a b k-B k+B·[B] [B] to 1/to=b+k+B·[B] k+B=(1/to-b)/[B] s-1 mM ms ms-1 M-1·s-1 500 1000 100 50 0.67 1.49 9.9 250 25 0.81 1.23 9.3 10 0.913 1.10 9.5 5 0.95 1.05 9.6 - 1 1.00 Effetto della [B] sulla cinetica 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 10 20 30 40 50 60 [B] ( m M) b +k * [B] k+B b

[B]=50 mM to=0.67 ms

[B]=25 mM

[B]=10 mM

[B]=5 mM

[B]=0

Un semplice schema di blocco cont. Sappiamo inoltre che in assenza di bloccante MOT=1/b quindi, possiamo ricavare k+B·[B]. Inoltre, possiamo ricavare la costante di dissociazione del bloccante KD in quanto KD=k-B/k+B (Neher & Steinbach, 1978). Pertanto, in questo semplice schema tutte e quattro le costanti di velocità e la KD possono essere determinate dall’analisi dei tempi di chiusura e di apertura. Un approccio alternativo è il seguente (Colquhoun & Hawkes, 1983): Mean open time per burst = Mo· Mr = 1/b dove Mo=mean OT, Mr= numero medio di aperture per burst e Mean closed time per burst = Mc · Mr = CB/b dove CB = [B]/KD

Un canale con due stati chiusi distinti 4 Un canale con due stati chiusi distinti C2 k +1 k -1 C1 a b O MOT = 1/b MC1T = 1/(a+k-1) MC2T = 1/k+1 E’ Inoltre possibile ricavare che: il numero medio di aperture per burst MOB=(a/ k-1)+1 il(Colquhoun & Hawkes, 1981) (Johnston & Wu, Foundations of Cellular Neurophysiology p. 268) C O burst

Registrazioni di singolo canale da canali del Ca2+ Registrazioni di singolo canale da canali del Ca2+. Configurazione di cell-attached con la pipetta di patch riempita con Ba2+. Il bagno contiene una soluzione salina normale. Risposte a depolarizzazioni di circa -5 mV (sinistra) e +15 mV (destra). Nel pannello di destra il livello di corrente zero è indicato con linee orizzontali. Le ampiezze medie di singolo canale sono 0.9 pA a -5 mV, e 0.6 pA a +15 mV. Filtro passa-bassi a 1 kHz. Istogramma dei tempi di chiusura per gli stessi dati a -5 mV . L’istogramma è stato interpolato con un doppio esponenziale con costanti di tempo tc = 1.05 ms e ts = 25.5 ms.. tc rappresenta la durata media delle brevi chiusure all’interno dei bursts osservabili nel pannello di sinistra di (A). ts rappresenta il tempo medio tra eventi indipendenti. Il numero medio di aperture per burst è 0.57. Istogramma dei tempi di apertura per i dati a -5 mV (pannello di sinistra di (A). L’istogramma è stato interpolato con un singolo esponenziale la cui costante di tempo è to = 0.81 ms.

Our motivation was to learn more about the mechanisms by which the Ca channel operates. Correnti di singolo canale (A), e istogrammi dei tempi di apertura, chiusura e latenza (B), calcolati dalle correnti in (A). Istogramma dei tempi di apertura: interpolato con un singolo esponenziale (costante di tempo di 1.2 msec). Istogramma dei tempi di chiusura: la linea continua è ottenuta dqall’interpolazione con il doppio esponenziale A1exp(-t/tc1) +A2exp(-t/tc2). A1/A2 = 4.5 = numero medio di aperture per burst. Istogramma delle latenze: il picco più alto è a circa 5-6 ms, suggerendo la presenza di una fase di attivazione.

È prevista cooperatività nell’attivazione dei canali del Na e del K 3b ¬ ¾ a ® O C2 C3 2b 2a b 3a Equivalente lineare della cinetica m3 secondo il modello di H&H C1 b ¬ ¾ 3a ® O C2 C3 2b 2a 3b a Cooperatività positiva 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 Entrambi gli schemi predicono lo stesso andamento temporale dell’attivazione (a livello macroscopico), tuttavia il modello di destra non è più interpretabile come l’apertura di tre gates m identiche e indipendenti. Piuttosto, esso potrebbe essere interpretato come un’attivazione con cooperatività positiva in cui ciascuna gate è più facile da aprire della precedente.

Un semplice schema di attivazione da agonista 5 Un semplice schema di attivazione da agonista k +1 a A+R AR AR* k -1 b (open) MOT = 1/b Il tempo di chiusura sarà la somma dei tempi trascorsi negli stati A e AR: MCT = 1/(a+k-1) + 1 /(k+1·[A]) Questo potrà essere separato in due componenti di tempi di chiusura se le costanti di velocità sono significativamente differenti. Tempo medio in AR (chiusure dentro i burst) = 1/(a+k-1) Tempo medio di chiusura tra i burst) = 1/(k+1·[A]) MOB= a/k-1 + 1

Bibliografia Colquhoun & Hawkes (1977) Proc R Soc Lond [Biol] 199:231-262. Colquhoun & Hawkes (1983) in Single channel recording eds. Neher & Sakmann, Chapter 9. Neher & Steinbach (1978) J Physiol 277:153-176.

FINE