Ras e Rap sono coinvolti nel controllo del traffico dei recettori AMPA durante certe forme di plastiicità sinaptica

Un esempio di piccole proteine G monomeriche La famiglia Ras Un esempio di piccole proteine G monomeriche Rap-GEF Vi è un certo numero di famiglie di proteine G monomeriche, tra le quali la famigliqa Ras che annoverano oltre 50 membri. Due importanti membri sono Ras stesso e Rap. Mutazioni che bloccano Ras in uno stato costitutivamente attivo sono presenti in circa il 45% dei tumori maligni. Ras controlla vie che sono neoplastiche: ad es. Crescita e divisione cellulare. Rap ha l’effetto opposto. Un modus operandi in coppia per controllare processi opposti viene spesso osservato nelle proteine G monomeriche. Proneo- plastico Antineo- plastico Rap-GAP

La famiglia Ras Motivazione per questo studio Zhu et al. (2002) Cell 110: 443-455 Motivazione per questo studio Ras-GAP è stata trovata nelle sinapsi Le MAPK, effettori a valle di Ras, e la CaMKII, attivatore di Ras, sono stati implicati nell’LTP Mutazioni in Ras o Ras-GAP sono collegate a forme di ritardo mentale Ras e Rap sono state viste essere coinvolte nella regolazione del traffico dei recettori AMPA (Zhu et al. 2002).

La famiglia Ras Motivatione per questo studio Ras-GAP è stata trovata nelle simapsi Le MAPK, effettori a valle di Ras, e la CaMKII, attivatore di Ras, e sono stati implicati nell’LTP Biolistics transfection Sindbis virus infection Mutazioni in Ras o Ras-GAP sono collegate a forme di ritardo mentale Come hanno fatto? Over-espressione di Ras e Rap Espressione di Ras e Rap mutanti non funzionanti Quale preparazione cellulare?

La famiglia Ras Motivatione per questo studio Ras-GAP è stata trovata nelle simapsi Le MAPK, effettori a valle di Ras, sono stati implicati nell’LTP Mutazioni in Ras o Ras-GAP portano a ritardo mentale Come hanno fatto? Over-espressione di Ras e Rap Espressione di Ras e Rap mutanti non funzionanti Lo studio di Zhu et al. utilizza sezioni sottili di tessuto di ippocampo, con elettrodi che stimolano le fibre collaterali di Shaffer e un elettrodo da patch clamp posizionato su una cellula piramidale della regione CA1. Si sono ottenute registrazioni di whole-cell simultanee da coppie di neuroni adiacenti infettati/transfettati e non infettati/transfettati, questi ultimi utilizzati come controllo (era possibile identificare I neuroni infettati/transfettati grazie al fatto che I costrutti genici contenevano una proteina fluorescente (GFP). Over-esprimendo o introducendo mutanti inattivi di Ras e Rap essi poterono dimostrare il coinvolgimento di Ras e Rap nel pilotare rispettivamente l’inserzione in membrana e l’endocitosi di recettori AMPA. ----------------------------- Nota 1: l’over-espressione di proteina G porta a livelli alti di quella proteina nella cellula, e quindi ad alti livelli della forma attiva della proteina nella cellula (anche i livelli della forma inattiva saranno alti, ma non serviranno a niente). Nota 2: gli esperimenti son stati condotti con recettori AMPA elettrofisiologicamente marchiati, per dimostrare che la manipolazione di Ras/Rap influenzava l’espressione di recettori AMPA in membrana (una marchiatura elettrofisiologica consiste nel produrre una mutazione nel gene che codifica per una delle subunità, cosicchè quando la subunità viene transfettata ed espressa e la proteina viene incorporata in un recettore, il recettore mostrerà una proprietà elettrofisiologica identificabile – per esempio il grado di rettificazione – di modo che sia possibile stabilire se il recettore è presente in membrana). Quale preparazione cellulare? stimolazione registrazione Neurone piramidale in CA1 Collaterali Di Schaffer Cosa hanno concluso?

Registrazioni extra- ed intracellulari in una slice di Ippocampo stimolo elettrodo di registr.

Rap-GEF Rap-GAP Cosa hanno concluso?

? AMPA AMPA p42/44 MAPK Rap-GEF LTD Rap-GAP Nel loro lavoro gli autori poterono dimostrare che l’over-espressione di Ras porta all’incorporazione in membrana di recettori AMPA (marchiati elettrofisiologicamente) e anche all’LTP L’over-espressione di Rap porta alla perdita di recettori (elettrofisiologicamente marchiati) dalla membrana e anche all’LTD. L’analisi dei recettori elettrofisiologicamente marchiati mostrò che Ras porta all’inserzione in membrana di recettori a coda lunga (contenenti la subunità Glu1), mentre Rap portava alla perdita dalla membrana di recettori a coda corta (cioè contenenti subunità Glu3 invece di Glu1). L’espressione di forme mutanti di Ras inattive portava ad un blocco dell’inserzione in membrana di recettori, ed anche ad una incapacità a produrre LTP. L’espressione di forme mutanti di Rap inattive portava ad un blocco della perdita dalla membrana di recettori, ed anche ad una incapacità a produrre LTD. ---------------------- Studi precedenti avevano dimostrato che Ras-GAP a livello sinaptico può essere fosforilato dalla CaMKII. In questo studio gli autori dimostrano che forme mutate di Ras bloccano l’effetto della CaMKII di indurre l’LTP, mentre l’over-espressione della forma attiva di Ras mima gli effetti dell’attivazione della CaMKII. Pertanto nel loro modello gli autori mettono Ras a valle della CaMKII e suggeriscono che la CaMKII regola Ras. L’over-espressione di Rap mima l’LTD e attiva la MAPK p38, un noto effettore a valle di Rap in altri sistemi. Essi proposero che la MAPK p42/44, un effettore a valle di Ras in altri sistemi, sarebbe pure coinvolto a livello sinaptico. Rap-GAP

Modello per il traffico di AMPA-R regolato dalle GTPasi Ras e Rap p42/44 MAPK AMPA Pathway di sinistra: Una forte attivazione di NMDA-R induce un forte ingresso di ioni Ca2+ Gli ioni Ca2+ attivano la via di signalling CaMKII-Ras-p42/44MAPK. Questa via favorisce l’inserzione in membrana di recettori AMPA.

Modello per il traffico di AMPA-R regolato dalle GTPasi Ras e Rap LTD Rap-GEF Rap-GAP AMPA Pathway di destra: Una bassa attivazione di NMDA-R induce l’ingresso di una piccola quantità di ioni Ca2+ (?) Viene attivata la via di signalling Rap-p38MAPK. Questa via promuove l’internalizzazione di recettori AMPA. L’attivirà di Rap endogena contribuisce ad una depressione tonica della trasmissione. L’attività sinaptica spontanea attiva recettori NMDA che a loro volta (???) attivano Rap producendo una depressione tonica della trasmissione (gli effetti di Rap sono bloccati dall’antagonista dei recettori NMDA APV).