Le tecniche di coltura in vitro Francesco Sunseri

La definizione “… the aseptic culture of plant protoplasts, cells, tissues or organs under conditions which lead to cell multiplication or regeneration of organs or whole plants “ (Murashige, 1963) Additional Points: Growth of plant cells outside of an intact plant A technique essential to many areas of plant science Culture of individual or groups of cells and whole organs contribute to the understanding of both fundamental and applied science Cultures can be sustained and maintained as a mass of undifferentiated cells for an extended period of time or regenerated into whole plants

Argomenti da trattare: Concetti fondamentali / Storia Tipi di cellule o tessuti Processi di crescita Regolatori di crescita

Che cosa sono La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo fondamento nella totipotenza cellulare In tutte le piante vascolari l’embrione si evolve in una struttura bipolare per la presenza di due meristemi apicali Durante il ciclo della pianta tali meristemi producono continuamente nuovi organi che si aggiungono a quelli prodotti durante l’embriogenesi

Che cosa sono Le piante vascolari sono state pertanto definite organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di tale fenomeno nelle piante non si assiste alla separazione tra linea somatica e linea germinale Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le strutture tipiche della riproduzione Per entrambe queste ragioni nelle piante vascolari qualsiasi cellula somatica può considerarsi un progenitore potenziale di un nuovo individuo …

Coltura in vitro Il termine sottende a differenti metodologie che consentono la crescita e lo sviluppo di cellule, tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si può indurre anche da tessuti già differenziati che subiscono un processo di sdifferenziamento Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli, che possono essere mantenuti indefinitamente in vitro o possono essere indotti a rigenerare organi o piante intere

Callo Rappresenta la naturale risposta della pianta ad una ferita E’ una massa di cellule in attiva divisione per la produzione di cellule indifferenziate prodotte da espianti di tessuto vegetale E’ formato da cellule totipotenti

Coltura in vitro Tutti i vegetali possono essere considerati sorgenti potenziali di cellule per coltura in vitro Alcune specie sembrano fare eccezione a tale regola, ma è probabile una erronea scelta delle condizioni colturali Infatti le condizioni colturali possono mostrare differenze significative in relazione a sostanze specifiche e condizioni microambientali utilizzati

Principali caratteristiche Si effettuano: su micro scala in condizioni ambientali ottimizzate (nutrienti, luce, temperatura) in assenza di microrganismi (funghi, batteri, virus).

1. Storia Teoria cellulare e totipotenza Formazione del callo e sostanze di crescita Prime colture cellulari Prime colture di tessuti vegetali Colture di organi vegetali

Teoria cellulare …. Le cellule furono osservate per la prima volta nel 1664 da Robert Hooke, che studiò con un microscopio rudimentale sottili fettine di sughero e vide che esse erano formate da elementi di forma regolare. Egli chiamò cellule questi elementi (dal latino cellula, "piccola stanza"), perché esse avevano l'aspetto di piccole scatole. Cork tissue as observed by Robert Hooke in 1664

Le prime colture cellulari…. …Haberlandt .. agli inizi del 1900 … propose il concetto di totipotenza … cellule allevate in adatte conditizioni Callo coltivato a partire dal cambio (Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930) … le cellule restavano vive ma non si moltiplicavano

Le prime colture di tessuti …. - in funzione della scoperta dei “Regolatori di crescita” Distensione cellulare … ruolo delle auxine Divisione cellulare ... ruolo delle citochinine Rigenerazione di tabacco .... (Skoog and Miller) …. interazione tra auxine e citochinine dava differenziazione.

Successivi sviluppi … GA per la crescita dei germogli Aux + Cyt + zucchero > sviluppo vascolare Colture di ‘strati sottili’ … interazione con altri fattori es. pH

Il primo uso commerciale di piante propagate su mezzo artificiale è stato fatto per la germinazione e lo sviluppo di orchidee nel 1920

Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964

Pianta di tabacco da singola cellula – Vasil & Hilderbrandt 1965

Coltura di organi vegetali … Coltura di organi vegetali …. … ma la coltura delle piante in vitro ha visto il suo pieno sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962  micropropagazione

2. Tipi di cellule e tessuti Molti tipi di cellule Grado di specializzazione diversificato - Meristematico - Embrionale - Riproduttivo

Tessuti meristematici ... Germoglio ... apicale, … ascellare

tunica new leaf corpus pith cortex apical meristem leaf trace axillary meristem procambium

Tessuti meristematici ... Germogli ... apicali, … ascellari Foglie Radici

Tessuti embrionali ... Piante pre-formate Germinali / somatici Giovanile

Tessuti riproduttivi ... Diploide / Aploide Femminile / Maschile

3. Processi di crescita Moltiplicazione Dominanza apicale Differenziazione Crescita Divisione cellulare Distensione cellulare Fasi di sviluppo Giovanilità Dormienza

3. Altri processi Fotosintesi Traspirazione e assorbimento dell’acqua Instabilità citologica Meccanismi fisiologici Manipolazioni fisiche Ambiente Genotipo

4. Regolatori di crescita Le auxine Le citochinine Le gibberelline (GA) L’acido abscissico (ABA) L’etilene

Regolatori di crescita Auxine Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3-Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e più stabili Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptili Promuovono la radicazione Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in quelli apicali (inibizione della crescita delle gemme laterali)

Regolatori di crescita Citochinine Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin Stimola la divisione cellulare Promuove la formazione di gemme avventizie Sono sintetizzate nel meristema radicale e trasportate nel floema sotto forma di Zeatin-riboside

Regolatori di crescita Gibberelline Questa classe comprende più di 70 composti, varie forme dell’ acido gibberellico In commercio sono disponibili diversi formulati (GA3, GA4, GA9) Stimola l’eziolatura dello stelo Sintetizzate nelle giovani foglie

Regolatori di crescita Acido abscissico (ABA) Esiste solo un componente naturale Promuove l’abscissione delle foglie e la dormienza dei semi Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli stomi in condizioni di stress idrico Ha un ruolo importante nell’embriogenesi (aiuta la formazione di embrioni normali)

Bilancio ormonale Auxine Citochinine Alte Basse Basse Alte Formazione di radici dopo il taglio Embriogenesi Formazione di radici avventizie Induzione a callo Formazione di germogli avventizi Crescita di germogli ascellari

Rapporto auxine : citochinine

Azione dell’ormone per ….. Applicazione + assorbimento Endogeno + applicato Accumulazione e assuefazione Interazione / Sequenza di applicazione Impulso o esposizione prolungata

Mezzo di coltura in vitro Elementi minerali (17 elementi essenziali) Fonte d’energia e di carbonio (saccarosio) Regolatori di crescita (fitormoni) Vitamine Composti organici Acqua pH (5.0-5.7) Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum

Composti inorganici Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e microelementi (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si). Disponibili formulazioni commerciali in polvere Murashige and Skoog Medium (1965) è il mezzo di coltura più comune Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente utilizzato per colture cellulari in sospensione.

Vitamine Un ampio range di vitamine sono disponibili e possono essere usate Generalmente, più è piccolo l’espianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamine Un cocktail di vitamine è spesso usato L’inositolo di solito deve essere aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l)

Vitamine Tiamina Piridossina Acido nicotinico Biotina Acido Citrico Acido Ascorbico Myo-inositolo

La rigenerazione può avvenire via organogenesi via embriogenesi somatica

Organogenesi L’organogenesi prevede la formazione di germogli, foglie e radici e si verifica quando si differenziano in vitro centri meristematici unipolari quali le gemme avventizie Questi organi possono derivare da meristemi preesistenti o da cellule indifferenziate Come per l’embriogenesi può aversi una fase intermedia di callo, ma spesso si osserva senza il passaggio da questo stadio

Organogenesi La differenziazione di radici e germogli in colture di tessuto di tabacco era funzione del rapporto auxine-citochinine, e la differenziazione dell’organo potrebbe essere regolato dal cambiamento delle concentrazioni relative delle due sostanze nel mezzo di coltura 1957 Skoog and Miller

Embriogenesi Somatica L’embriogenesi somatica consiste nella produzione di embrioni da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dell’embrione zigotico Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un embrione cotiledonare

Acclimatamento Le piante ottenute in vitro devono essere preparate alla sopravvivenza in vivo Alta umidità Luce Temperature tra 20-25°C Elementi nutritivi Terreno adatto

Applicazioni delle colture in vitro micropropagazione e rapida moltiplicazione di cloni rigenerazione e trasformazione genetica induzione di variazione somaclonale ottenimento di aploidi da micro e macrospore allevamento e mantenimento di piante virus esenti manipolazione di protoplasti ed ibridazione somatica conservazione del germoplasma produzione di metaboliti di interesse industriale

Plant Genetic Transformation

Overview Introduzione Plant genetic transformation Stato attuale delle PGM Trends futuri e problemi

Introduzione Potenzialità delle biotecnologie vegetali Uso di nuovi geni introdotti Tratti che i plant breeders vorrebbero trasferire

Tratti genetici di interesse per i plant breeders Resistenza a stress idrico Resistenza a stress biotici Adattabilità alla meccanizzazione Insensibilità al fotoperiodo Eliminazione di composti tossici Alta produttività Alta qualità nutrizionale Adattabilità all’inter-cropping Fissazione dell’azoto

Sviluppo dei cibi GM 1950 Prima rigenerazione di piante intere da in vitro culture 1973 La ricerca sviluppa capacità ad isolare geni 1^ pianta transgenica : tabacco resistente ad antibiotico 1983 PGM resistenti a insetti, virus e batteri sono saggiate in campo per la prima volta – TRATTI UTILI 1985 1990 Primo campo di cotone GM condotto con successo Pomodoro Flavr-Savr – 1^ FDA approvazione per un cibo 1994 Soia Roundup della Monsanto approvata per il commercio negli Stati Uniti 1995

Metodi di trasformazione genetica Trasformazione biologica Biolistico - gene gun o particle gun Elettroporazione Microiniezione

Trasformazione biologica Agrobacterium tumefaciens & A. rhizogenes causano infezione nelle piante le formazioni tumorali sono la conseguenza del trasferimento, da parte del batterio, di un segmento di DNA, chiamato T-DNA

Agrobacterium gene transfer

Esempio di protocollo per la trasformazione con Agrobacterium Sterilizzare Espianto fogliare Incubare con Agrobacterium Blot disk dry Leaf disk Trasferire su mezzo di induzione del germoglio + carbenicillina; in coltura ~ 2 giorni Transferire su mezzo per indurre germoglio + carbenicillina + selettivo per il transgene (es. kanamicina), coltivare/subcoltivare fino a che si formano i germogli Trasferire le plantule nel terreno appena si formano le radici Excidere i germogli dal callo, trasferire su mezzo di radicazione

Tratti transgenici inseriti 74% resistenza ad erbicidi (soia, canola) 19% resistenza ad insetti (mais, cotone) 7% altri caratteri