16.1 INTRODUZIONE Figura 16.1 Campi di applicazione delle colture in vitro nel miglioramento genetico delle piante e nell’attività vivaistica.

16.2 MICROPROPAGAZIONE A B Figura 16.2 Panoramica di una camera di crescita (A) e particolare di vasi contenenti espianti vegetali al termine di una subcultura di proliferazione (B).

16.2 MICROPROPAGAZIONE Figura 16.3 Modelli di rigenerazione in vitro secondo A. Standardi et al. (1999).

16.2 MICROPROPAGAZIONE A B D C E Figura 16.4 Esempi di organogenesi ed embriogenesi diretta e indiretta, rispettivamente in giglio (A-C) e in melo (D-E) (foto: A. Standardi).

16.2 MICROPROPAGAZIONE PROPAGAZIONE PER GERMOGLI ASCELLARI Figura 16.5 Schema di micropropagazione con espianti di diversa natura (fonte: A. Standardi).

16.2 MICROPROPAGAZIONE PROPAGAZIONE PER GERMOGLI ASCELLARI A B C Figura 16.6 Propagazione in vitro: dal germoglio iniziale alla plantula radicata. Fasi di allestimento (A), proliferazione (B) e radicazione (C) del portinnesto M26 di melo.

16.2 MICROPROPAGAZIONE ORGANOGENESI Figura 16.7 Dosaggi di citochinine e auxine in relazione alle esigenze (emissione di germogli o radici oppure alla produzione di callo) della coltura in vitro.

16.2 MICROPROPAGAZIONE ORGANOGENESI A B Figura 16.8 Processi di caulogenesi e rizogenesi a partire, rispettivamente, da callo di ginestrino (organogenesi indiretta) (A) e da tessuti fogliari di melo (organogenesi diretta) (B) (foto: A. Standardi).

16.2 MICROPROPAGAZIONE EMBRIOGENESI Figura 16.9 Fasi dell’embriogenesi somatica.

16.2 MICROPROPAGAZIONE EMBRIOGENESI Figura 16.10 Formazioni embrioidiche riconducibili agli stadi a sfera, cuore e torpedo.

16.2 MICROPROPAGAZIONE EMBRIOGENESI A B Figura 16.11a Fasi dell’embriogenesi somatica in carota. Figura 16.11b Callo con strutture embrioidiche (A) ed embrione somatico maturo di erba medica (B).

E SOSPENSIONI CELLULARI 16.3 COLTURE DI CALLI E SOSPENSIONI CELLULARI A B C Figura 16.12 Coltura di calli su piastra Petri (A) e particolari di espianto in fase di formazione del callo (B) e di callo in fase di proliferazione (C).

E SOSPENSIONI CELLULARI 16.3 COLTURE DI CALLI E SOSPENSIONI CELLULARI A B C Figura 16.13 Sospensione cellulare: beuta con sospensione liquida (A), piastra con sospensione concentrata (B) e particolare degli aggregati cellulari del callo (C).

E SOSPENSIONI CELLULARI 16.3 COLTURE DI CALLI E SOSPENSIONI CELLULARI Figura 16.14 Fasi per l’ottenimento di colture cellulari in sospensione (modificata da: E.F. George, 1993).

E SOSPENSIONI CELLULARI 16.3 COLTURE DI CALLI E SOSPENSIONI CELLULARI Figura 16.15 Curva di crescita di una sospensione cellulare.

E SOSPENSIONI CELLULARI 16.3 COLTURE DI CALLI E SOSPENSIONI CELLULARI METABOLITI SECONDARI Figura 16.16 Strutture di alcaloidi biologicamente attivi e piante che li producono (fonte: T.M. Kutchan, 1995).

16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE Tabella 16.1 Varianti somaclonali isolate in mais ed erba medica.

16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE Figura 16.17 Ottenimento di calli chimerici e rigenerazione di mutanti.

16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE Figura 16.18 Livello di variabilità genetica nelle piante rigenerate in relazione al tipo di espianto.

16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE Tabella 16.2 Varianti somaclonali riguardanti la resistenza a stress biotici originatisi durante la coltura in vitro nelle piante da frutto (modificato da: F.A. Hammershlag, 1992).

16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE B C D E F G Figura 16.19 (A) Uniformità dei profili RAPD generati con il primer OP-P7 impiegando DNA genomico isolato dalle plantule rigenerate mediante ABP e subcololturate per 12 mesi. (B-G) Variabilità dei profili RAPD generati da diversi primer 10-mer impiegando DNA genomico isolato da alcune delle plantule rigenerate mediante ISE.

RECUPERO IN VITRO DI EMBRIONI 16.5 EMBRYO RESCUE: RECUPERO IN VITRO DI EMBRIONI Figura 16.20 Embryo rescue: esempio di recupero in vitro di embrioni di Poa pratensis indotti in vivo mediante trattamenti auxinici.

MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI 16.5 IBRIDAZIONE SOMATICA MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI Figura 16.21 Schema di ibridazione somatica: isolamento e fusione dei protoplasti, riconoscimento degli eterocarionti, proliferazione del callo e rigenerazione delle piante anfidiploidi.

MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI 16.5 IBRIDAZIONE SOMATICA MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI Figura 16.22 Rappresentazione schematica dei prodotti di fusione ottenibili con l’ibridazione somatica.

MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI 16.5 IBRIDAZIONE SOMATICA MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI Figura 16.23 Ibridazione somatica tra M. sativa e M. arborea usando protoplasti isolati da callo o sospensione cellulare e protoplasti isolati da mesofillo fogliare. (A-D) fusione dei protoplasti; (E) protoplasti da mesofillo; (F) protoplasti da callo; (G) prodotto di fusione con fluorescenza rossa (cloroplasti) e giallo-verde (FITC); (H) microcallo; (I) plantula rigenerata; (L) analisi isoenzimatica delle esterasi nelle linee parentali e nell’ibrido somatico (foto: S. Arcioni). A B C D E F G H I L

MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI 16.5 IBRIDAZIONE SOMATICA MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI Tabella 16.3 Condizioni di reazione per l’isolamento di protoplasti in tabacco e nei cereali.

MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI 16.5 IBRIDAZIONE SOMATICA MEDIANTE FUSIONE DI PROTOPLASTI COLTURE IN VITRO F. K. SKOOG E T. MURASHIGE Figura 16.24 Folke K. Skoog (1908-2001).

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Figura 16.25 Rappresentazione schematica della coltura di antere per l’ottenimento di piante omozigoti.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Figura 16.26 Modelli di sviluppo della microspora fino alla formazione di un proembrione androgenetico.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Figura 16.27 Tipi di morfogenesi: differenziazione diretta e indiretta di piante aploidi a partire dal proembrione androgenetico.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI B Figura 16.28 Rappresentazione schematica di una spighetta (A); struttura fiorale tipica delle graminacee con in evidenza antere e pistillo (B).

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Figura 16.29 Sviluppo dei boccioli fiorali (A) in relazione agli eventi della microsporogenesi (B) in peperone: tetrade di microspore, polline immaturo uni, bi e trinucleato maturo.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Tabella 16.4 Costituzione di alcuni substrati di coltura idonei per l’induzione (m-l) androgenetica delle spore, la rigenerazione (m-R) e il mantenimento (m-M) delle plantule androgenetiche.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI B C D E F G H I L M N O Figura 16.30 Processo di androgenesi in peperone: microspora uninucleata; (B) microspora binucleata (con nucleo vegetativo e generativo); (C) microspora trinucleata; (D) microspora tetranucleata (con soli nuclei vegetativi); (E) microspora plurinucleata (con un nucleo generativo); (F) proembrione (sono visibili le pareti cellulari); (G-I) antere con calli e plantule in rigenerazione; (L) plantule aploidi; (M) piante diploidizzate; (N) metafase aploide; (O) metafase diploide.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI B C D E F H I L M N O R P Q Figura 16.31 Processo di androgenesi in loietto: porzione di antera con microspore; (B) microspora matura; (C-D) microspora bi- e tetranucleata (V = nuclei vegetativi); (E) microspora plurinucleata con due nuclei generativi (G); (F) proembrioni entro l’antera; (G) proembrioni con parete cellulare ricostituita (W); (H) antera con calli in formazione; (I) antere con strutture proembrionali; (L) embrione androgenetico; (M) callo in fase di rizogenesi; (N) particolare dell’apice radicale; (O) emissione del germoglio; (P) plantula rigenerata; (Q) plantula albina; (R) metafase aploide (n=x=7).

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI B Figura 16.32 Cariotipo di una pianta aploide androgenetica (3200 X); (B) cariotipo di una pianta diaploide androgenetica (3200 X) costituiti, rispettivamente, da 10 cromosomi metacentrici o sub-metacentrici e due cromosomi acrocentrici; uno degli acrocentrici presenta un satellite, mentre uno dei sub-metacentrici è molto più lungo dei restanti del corredo (la freccia indica il satellite).

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI B C D E F G Figura 16.33 Pianta diaploide di peperone alla maturazione dei frutti; (B-C) differenze nella dimensione e nella forma dei frutti tra genotipi donatori e diaploidi; (D-G) variabilità del numero, della forma e della dimensione dei semi riscontrata nei frutti delle piante diaploidi.

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Tabella 16.5 Schema di costituzione di una varietà di frumento impiegando la coltura di antere (H deriva dal termine inglese haploid).

16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE ANDROGENESI E GINOGENESI Tabella 16.6 Principali risultati ottenuti con la coltura di antere nelle specie arboree.

16.7 SEME SINTETICO A B Figura 16.34 (A) Embrione somatico maturo di erba medica; (B) Embrione incapsulato in alginato di sodio (seme sintetico).

16.7 SEME SINTETICO Figura 16.35 Confronto tra embriogenesi somatica e zigotica.

16.7 SEME SINTETICO Figura 16.36 Protocollo di incapsulamento di materiale di propagazione rappresentato da microtalee ed embrioni somatici (fonte: M. Micheli).

16.7 SEME SINTETICO Figura 16.37 Propaguli bipolari e unipolari ottenuti in vitro per la produzione di seme sintetico: (A) embrione somatico di finocchio (Foeniculum vulgare); (B) bulbillo di giglio (Lilium longiflorum Thumb.); (C) microtalea ascellare del portainnesto M26 di melo (foto: M. Micheli).

16.7 SEME SINTETICO Tabella 16.7 Elenco delle specie dove sono stati impiegati propaguli vegetativi derivati in vitro di natura non embrioidica per l’ottenimento di semi sintetici.