Marcatori Molecolari Introduzione Marcatori proteici DNA Marcatori RFLP PCR Marcatori RAPD Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi Considerazioni Applicazioni

Introduzione Che cosa sono i Marcatori Molecolari ?? I fattori ambientali possono influenzare i caratteri morfologici I marcatori molecolari (MM) focalizzano la diversità del materiale genetico e misurano le variazioni controllate da geni I MM possono essere usati per : misurare diversità genetica costituire mappe genetiche selezione assistita (MAS) supporto all’isolamento genico (PC) Che cosa sono i Marcatori Molecolari ?? Marcatori Molecolari sequenze proteiche e di DNA facilmente individuabili e la cui eredità può essere controllata Polimorfismo in proteine proteine del seme isoenzimi ed alloenzimi Polimorfismi di DNA nucleare citoplasmatico

Proprietà desiderabili Polimorfico Eredità codominante Distribuito in tutto il genoma Facile e veloce da individuare Poco costoso Riproducibile / Trasferibile Nessun marcatore le possiede tutte Marcatori proteici Breve introduzione alle proteine Proteine di conservazione del seme Isoenzimi Alloenzimi

Struttura delle proteine Struttura primaria – backbone del polipeptide Struttura secondaria – legami ad idrogeno locali Struttura terziaria – legami che coinvogono i gruppi R Struttura quaternaria – interazione tra polipeptidi

Proteine ed ambiente Proteine seed storage La struttura tridimensionale delle proteine è il risultato dell’interazione con l’ambiente. Bisogna quindi tenere conto della denaturazione delle proteine …. …. e della diversità della loro funzione … …facilitata dalla complessità di struttura Proteine seed storage Perché usiamo le proteine del seme ?? i semi sono ricchi di proteine le proteine sono disponibili in sufficiente quantità i semi sono uno stadio dello sviluppo ben definito La metodologia si estraggono le proteine e si separano in elettroforesi si visualizzano sul gel con la colorazione (staining) si analizza il pattern delle bande

Isoenzimi ed Alloenzimi Considerazioni ed Applicazioni Considerazioni co-migrazione pattern delle bande complesso variazione intraspecifica Applicazione della tecnica es. frumento, orzo recentemente anche melanzana Isoenzimi ed Alloenzimi Forme multiple dello stesso enzima isoenzima : un enzima, più di un locus genico alloenzima : un enzima, un locus genico Metodologie tessuti macerati enzimi separati per elettroforesi visualizzazione per colorazione istochimica analisi del pattern

Interpretazione del pattern Formazioni di eteromeri Omozigote o eterozigote ?? Struttura quaternaria dell’enzima Numero di loci Numero di alleli Analisi genetiche spesso necessarie Formazioni di eteromeri

Applicazioni Marcatori su DNA Metodo potente e riproducibile per : caratterizzare/identificare genotipi studi di genetica di popolazione esaminare patterns di variazione geografica Limitato numero di enzimi disponibili Marcatori su DNA Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi

Le basi del DNA La sintesi del DNA

Restriction Fragment Length Polymorphism Marcatori RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Gli RFLP esaminano differenze in peso mole-colare di specifici frammenti di DNA ristretti Usualmente si utilizza il DNA totale Richiedono DNA puro e di alto peso molecolare Metodologia RFLP Tagliare il DNA in piccoli frammenti Separare i frammenti in gel eletttroforesi Trasferire i frammenti di DNA su filtro

Interpretazione dei Risultati Metodologia RFLP Visualizzazione dei frammenti di DNA sonde radioattive sonde non-radioattive Analisi dei risultati bande selezionate per presenza/assenza differenze nel pattern riflettono differenze genetiche La scelta di sonda ed enzima di restrizione è cruciale Interpretazione dei Risultati

Esempio di Analisi RFLP su fragola RFLP : vantaggi e svantaggi Riproducibili Marcatori codominanti Tecnica semplice Tecnica lunga e costosa Utilizzo di sonde radioattive

Polymerase Chain Reaction Marcatori su DNA Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi PCR Polymerase Chain Reaction Potente tecnica per amplificare il DNA Prevede l’utilizzo di cicli di temeperature step di denaturazione step di annealing step di elongazione Il DNA amplificato viene separato su gel elettroforesi

I tre passaggi della PCR PCR : componenti reazione Utilizzo della Taq polimerasi Condizioni di reazione Importanza della standardizzazione Una reazione contiene : target DNA Taq polimerasi uno o più starter o primer 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP buffer di reazione con il cofattore MgCl2

Random Amplified Polymorphic DNA PCR : riassunto DNA polimerasi Apparecchio Thermal Cycler Profilo delle temperatura (programma) Concentrazione del DNA target Concentrazione dello ione Mg RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando primer arbitrari Metodo veloce per individuare polimorfismi Marcatori dominanti Problemi di riproducibilità

Interpretazione dei RAPDs I marcatori RAPDs sono anonimi I marcatori RAPDs sono dominanti Problemi di co-migrazione una banda, un frammento ? stessa banda, stesso frammento ? RFLP : vantaggi e svantaggi Semplici e veloci Poco costosi Non utilizza radioattivo Marcatori dominanti Problemi di riproducibilità Problemi di interpretazione

Sequence-Tagged Sites Marcatori su DNA Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi STS Sequence-Tagged Sites Utilizzano la PCR a partire da : Sequence-Tagged Microsatellites (STMS) Oligonucleotidi ancorati a MS inter-simple sequence repeat (ISSR) Sequence-characterized amplified regions (SCARs) Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)

Marcatori Microsatelliti Sequence-Tagged MS In genere single locus multiallelico Codominante Inter-simple sequence repeats Amplificano segmenti adiacenti sequenze ripetute (repeats) Marcatori dominanti SCARs and CAPS SCARs – sequence characterized amplified regions marcatore single locus derivante da frammento RAPD CAPS – cleaved amplified polymorphic sequence Marcatore locus specifico Prodotto di amplificazione RAPD utilizzato come sonda RFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism Marcatori su DNA Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Tecnicamente sfruttano la combinazione tra RFLP e PCR Il risultato è un fingerprint altamente informativo Il metodo diviene sempre più popolare

AFLP La Tecnica

Analisi RAPD su melanzana AFLP : vantaggi e svantaggi Altamente sensibili Altamente riproducibili Largamente applicabili Costosi Tecnicamente difficili Necessari radioisotopi Problemi di interpretazione Analisi RAPD su melanzana

Esempio di Analisi AFLP su vite