L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011

Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers 1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)

Sistema FACSCanto II BD Biosciences

Microscopia Citometria in fluorescenza 4

Citometria a Flusso (CFM) La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca una sorgente di eccitazione

FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA LASER sheath fluid campione

Generazione dei segnali di “scatter” Rifrazione & Riflessione: proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente. SSC GRANULOCITI MONOCITI FSC Diffrazione: proporzionale alle dimensioni della cellula rilevata lungo l’asse della luce incidente 0° LINFOCITI

La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma di dispersione denominato CITOGRAMMA nel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche

Sottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico -Citogramma - LINFOCITI MONOCITI NEUTROFILI EOSINOFILI LINFOCITI MONOCITI NEUTROFILI EOSINOFILI BASOFILI LINFOCITI MONOCITI NEUTROFILI LINFOCITI MONOCITI LINFOCITI COMPLESSITA’  VOLUME 

Immunofenotipizzazione cellulare - definizione - Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).

Pubblicazioni 123328 references (2010) 1st Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso 1st 123328 references (2010)

Requisiti per una buona analisi citometrica Esperienza dell’operatore Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)

Riproducibilità dei parametri di fluorescenza Linfoma Follicolare - diagnosi Linfoma Follicolare - MMR

Materiali idonei per indagini in CFM Liquidi: Sangue periferico Aspirati Midollari Leucaferesi Liquor Liquidi cavitari Solidi: Linfonodi Biopsie Agoaspirati

Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologia Quesito diagnostico (dialogo con i clinici) Caratteristiche del campione da analizzare Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali Regolazione dello strumento e “compensazione” delle fluorescenze Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni cellulari da analizzare Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e biologia molecolare Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva

Metodo di studio in citometria Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali Eventuale dimostrazione della loro clonalità Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)

Espressione del CD45 nei leucociti

Sangue Periferico vs Sangue Midollare

Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER

MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesi stem cell Blasto mieloide promielocita Mielo cita Meta mielocita granulo cita CD34 CD13 CD33 CD66c CD66b CD11c CD11b CD11a CD16 CD64 CD15

MATURAZIONE MIELOIDE monocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD36 CD64 CD11b stem cell Blasto mieloide promonocita Mono cita CD34 CD13 CD33 CD36 CD64 CD11b CD14

MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione 100 CD10 CD13 CD11b CD16 CD64 PROMIELO MIELO METAMIELO GRAN

Interpretazione su CD66b/CD11b Maturazione

Interpretazione su CD66b/CD11b Maturazione Mieloide Interpretazione su CD66b/CD11b BM normale Sindrome mielodisplastica + mature blocco maturativo blasti immature

Maturazione mieloide in BM normale CD11b CD13 CD16 CD16 CD10 CD11b CD64 CD15

Maturazione mieloide in BM con MDS CD13 CD11b CD16 CD16 CD11b CD10 CD64 CD15

Maturazione mieloide in BM con MDS

Maturazione monocitaria in BM con LMMC

Mean values of bone marrow leucocyte populations Cell count 34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0) Erythroid 10.8% (SD 5.7) Lymphocytes 12.4% (SD 5.9) CD3 61.4% (SD 15.1) CD4 29.3% (SD 11.3) CD8 30.8% (SD 13.1) NK 11.2% (SD 9.2) CD19 18.9% (SD 14.0) CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9) Monocytes (CD14) 3.2% (SD 1.5) CD34+ cells 0.9% (SD 0.7) Whole myeloid serie 72.2% (SD 8.7) Immature/blast 3.6% (SD 2.1) Promyelocytes 12.3% (SD 6.3) Myelo and metamyelo 28.4% (SD 11.4) band and mature 48.9% (SD 15.5) Eosinophils 1.9% (SD 1.5) Plasmacells 0.4% (SD 0.3) A. Santagostino

CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD11b PE-Cy7/CD117 APC/CD45 APC-Cy7

Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER NORMALE MDS

MDS ABNORMALITIES BY FCM Stetler-Stevenson, Blood 2001 Hypogranulation of PMN 84% CD11b/CD16 abnormal 70% CD13/CD16 abnormal 78% CD64+ granulocytes 66% CD10- granulocytes 11% CD45-dim blasts 53% CD56+ granulocytes 21% CD56+ monocytes 33% My-cells expressing non-My Ags 38% Stetler-Stevenson, Blood 2001

CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD11b PE-Cy7/CD56 APC/CD45 APC-Cy7

Maturazione linfoide B PROFILO ANTIGENCO Maturazione linfoide B stem cell Cellula pre-pre B Cellula pre B Cellula B CD34 nucleare TdT citoplasmatico CD79a CD19 CD10 CD20 CD22 citoplasmatico cµ SmIg

Maturazione linfoide B CD20 FITC/CD10 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD38 PE-Cy7/CD19 APC/CD45 APC-Cy7

Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative CD22 FITC/CD200 PE/ CD19 PerCP-Cy5.5 / CD5 PE-Cy7/ CD23 APC /CD45 APC-Cy7 MCL CLL

Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative Kappa FITC/Lambda PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD38 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7 MCL CLL

Presenza o assenza di marcatori nelle M. Linfoproliferative MCL CLL

Espressione di ZAP-70 nelle CLL

VALUTAZIONE HCL CD103 FITC/CD11c PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD25 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7

VALUTAZIONE T-LDGL CD57 FITC/CD5 PE/ CD3 PerCP-Cy5.5 / HLA-DR PE-Cy7/ CD8 APC /CD45 APC-Cy7

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale CD158b CD158a

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+ pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità CD158b CD158b CD158a CD158a CD158b CD158b CD158a CD158a

pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità

VALUTAZIONE PLASMACELLULE

Immunofenotipo plasmacellule normali Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 HV-450 1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19

Immunofenotipo plasmacellule trasformate Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 HV-450 1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19

Immunofenotipo plasmacellule trasformate CD19-CD56- CD19-CD56+

Plasma cells: normal vs clonal Normal & reactive MGUS CD45+/- CD38 +++/++ CD138 ++ CD56-/+ CD19-/+ CD117- CD20- k &/or l (monoclonal in a proportion of PCs) Myeloma CD56++ CD45- CD38 ++ CD138 CD19- CD117-/+ CD20- k or l (monoclonal) CD38 +++ CD138 ++ k & l (polyclonal) CD56- CD19+ CD20- CD45+ CD45+ CD38 +++ CD138 ++ CD56- CD19+ CD117- CD20- k & l (polyclonal) CD117- CD56++ CD45- CD38 ++ CD138 CD19- CD117-/+ CD20- k or l (monoclonal) Clonal Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998

MM: dimostrazione di monoclonalità

Immunofenotipi plasmacellulari IF2 % PC=15% % PC=19% % PC=5% IF3 IF4 IF1   IF1 IF2 IF3 IF4 CD19 + - CD56 % PC <0.4 >0.4 NS

fattori prognostici in CFM CD45 CD20 CD117 CD56 CD38   CD20+ CD38dim CD45- CD56- CD117+ IF1 / 18 IF2 3 1 IF3 9 13 5 31 IF4 2 12 10 TOT IF 11 15 33 42

Nuovi targets per la terapia contro il MM

Presenza di PC-MM su Sangue periferico: SANGUE MIDOLLARE MM SANGUE PERIFERICO MM SANGUE PERIFERICO NORMALE

Malattia Minima Residua Sensibilità strumentale = 1/10000 DIAGNOSI MMR Sensibilità strumentale = 1/10000

Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM: Conclusioni (I) Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM: distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche determina eventuali fattori prognostici identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma un’elevata sensibilità nel valutare la MMR possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico

Conclusioni (II) L’analisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari. E’ necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti. L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.