Nanobiotecnologie mineralogiche Giovanni Valdrè – Università di Bologna Workshop “Minerali e salute” Roma 14-15 Giugno 2007

INTRODUZIONE In un ampia varietà di applicazioni biotecnologiche, chimiche e nanoingegneristiche le reazioni hanno inizio da superfici. La combinazione delle biotecnologie con le scienze mineralogiche ha un gran potenziale per la generazione di substrati avanzati, la funzionalizzazione di nanoparticelle inorganiche per mezzo di componenti biologici ottimizzati dall’evoluzione (es. DNA come stampo per particelle legate a oligonucleotidi). Le proprietà elettrostatiche e topografiche delle superfici, delle macromolecole biologiche e relativi complessi possono essere usate per la sintesi e l’assemblaggio di componenti organici ed inorganici. Importanza dello studio del potenziale di superficie a livello nanometrico.

Imparando dalla natura “going back to nature” La natura offre nanopotenziali minerali confinati “going back to nature” Substrati sintetici per nanobiotecnologie Substrati naturali?

Campi di applicazione dei substrati Patterning di biomolecole su superfici solide per lo sviluppo di: substrati per analisi enzimatiche massive interazione DNA-enzimi biosensori miniaturizzati ed integrati (sensoristica, manipolazione, catalisi) bioelettronica (nanoelettronica molecolare) organizzazione di nanoparticelle guidata da biomolecole (conducting nanowires and quantum dots devices) legame selettivo di materiali componenti.

Campi di applicazione dei substrati enzimatici Microbiologia: rilevazione contaminazioni microbiche di cibo, acqua potabile Diagnostica clinica: rilevazione livelli enzimatici dei fluidi corporei e relative condizioni cliniche del paziente Biologia molecolare: supporti per clonazione Dna

substrati sintetici, patterning Esempi di substrati sintetici, patterning

(nucleosome-like structure) DNA wrapping (nucleosome-like structure) DNA sliding along RNA polymerase 50 nm DNA length: 1001 base pairs Guthold, M. et al. Biophys. J. 1999, 77(4) Beloin, C. et al., J. Biol. Chem. 2003, 278(7)

Substrati naturali Fillosilicati Studiati e osservati a livello nanometrico tramite AFM Simulato il potenziale elettrostatico tramite metodi numerici “multiphysics”

Nanotecnologie Microscopio a Forza Atomica amplificatori detector laser PC nanopunta scanner

Effetti della deposizione del DNA su substrati fillosilicatici atomicamente piani

DNA Importanza Biologica Trasporta l‘informazione genetica necessaria alla trasmissione dei caratteri ereditari. (Ma può essere anche un veicolo per il nanopatterning sui substrati)

Alcune forme di DNA S-DNA: B-form ds-DNA (double strand) sottoposto a tensioni > 65pN, si stira di 1.7 volte. Studio della transizione: B-DNAS-DNA C. Bustamante et al., Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics, Nature, Vol 421 (2003)

Deposito di DNA su altri fillosilicati e minerali a strati

Talc Pyrophillite Brucite Vermiculite

Chlorite

Chlorite 3D

Chlorite

SURFACE RATIO TO MUSCOVITE VOLUME RATIO TO MUSCOVITE DNA surface coverage SURFACE DNA % COVERAGE SURFACE RATIO TO MUSCOVITE DEPOSITED VOLUME (m3)/m2 VOLUME RATIO TO MUSCOVITE Muscovite 7 % 1 20 ·10-6 Biotite 42 % 6 147 ·10-6 7 Phlogopite 41% 145 ·10-6 Talc 76 % 11 387 ·10-6 20 Brucite 58 % 8 503 ·10-6 25 Chlorite 48 % 149 ·10-6

DNA surface coverage

PHENOMENOLOGICAL RULES Tri-octahedral structures present higher DNA concentration, condensation and deposition capacity than Di-octahedral ones. Tri-octahedral structures with a low mean layer charge have greater DNA affinity than high layer charge structures. Some phyllosilicates (e.g., Chlorites, Vermiculites) can “order” or “nanopattern” DNA.

Studio della Clorite (Perché? Per le caratteristiche di anisotropia) piste nanoconfinate potenziale invertito alla superficie presenza di gradini subnanometrici

Clorite studiata Triclinic clinochlore crystal (Space Group Cī ; IIb-4 polytype) Bruker X8-Apex fully automated four-circle diffractometer WDS ARL-SEMQ Microprobe Calculated formula [VI](Mg2.963 Fe2+0.275 Ti0.004 Al0.977 Cr3+0.052) [IV](Si2.963 Al1.037)O10(OH7.91 F0.009) Clinochlore according to Bayliss (1975) nomenclature tetrahedral sites filled with Si and Al (~25%), Fe3+ (~ 0.3%) octahedral TOT filled with Mg octahedral brucite-like layer filled with Mg and Al (~25%), Fe2+ (~3%) Ti, Cr, Mn found in octahedral sites

Clinocloro: SUPERFICI, ENERGIA, POTENZIALE B After cleavage, chlorite presents simultaneously on the same specimen surface zones of brucite (B) and zones of siloxanes (S) with lateral sizes ranging from a few nanometer to microns. EFM allows us to measure the thickness of the brucite layers. B S

Scansione 5x5 m, in Contact Mode in aria, di DNA (1 nM) su clinocloro. Le molecole di DNA si depositano esclusivamente sugli strati tipo brucite, ma realizzano dei ponti fra le piste.

Condensazione e conformazione del DNA su clorite DNA sullo strato positivo Disposizione “a ponte” con stretching del DNA Assenza di DNA sullo strato negativo

Condensazione e conformazione del DNA su clorite (osservazioni in liquido) 1mm

Misure e simulazioni teoriche dei potenziali nanoconfinati di superfici di minerali Microscopia a Forza Atomica e sue derivazioni: EFM KPFM MF-EFM Simulazioni numeriche multifisiche simulazione del potenziale di superficie (Maxwell’s laws) forze agenti sulla nanopunta (Maxwell Stress Tensor) deflessione elettro-meccanica (Maxwell Stress Tensor) forze di trazione sul DNA (Forza di volume elettrostatica)

Microscopia a Forza Elettrica (EFM) Modalità di funzionamento: Metodo a due passi (lift) Force Volume Modalità Statica viene acquisita una matrice bi-dimensionale di Curve di Forza, rappresentanti la distribuzione 3D del campo elettrico sopra una superficie. FE = kLDL DL = deflessione del cantilever Metodo a due passi (lift) Modalità Dinamica Teoria delle piccole oscillazioni: …Per comprendere a fondo la natura dell’interazione elettro-meccanica sonda-campione, e ottenere delle misure che siano legate solamente al campione e non anche al sensore utilizzato, sono stati avanzati diversi modelli analitici. una sonda ricoperta da un sottile film conduttivo viene fatta vibrare meccanicamente a zlift nm da una superficie. A = A0cos(ω0t) vibrazione meccanica in lift

Microscopia a Sonda Kelvin (KPFM): Metodo a due passi (lift) Microscopia a Sonda Kelvin (KPFM): eccitazione elettrica Vtip = Vdc + Vaccos(ωt) una sonda ricoperta da un sottile film conduttivo viene eccitata elettricamente a zlift nm da una superficie.

Accoppiamento elettro-meccanico: il Tensore delle Tensioni di Maxwell Modello Computazionale Accoppiamento elettro-meccanico: il Tensore delle Tensioni di Maxwell Utile per simulare la deflessione elettrostatica del cantilever e le forze elettrostatiche di trazione del DNA da parte dei nanogradienti di potenziale del clinocloro. La forza per unità di volume che agisce su un corpo dielettrico quando è sotto l’influenza di un campo elettrostatico esterno è espressa da: Il primo termine è l’ordinaria forza di volume elettrostatica; il secondo termine rappresenta una forza presente quando un dielettrico inomogeneo è immerso in un campo elettrico; l’ultimo termine, noto come termine di elettrostrizione, da una forza di volume per un dielettrico in un campo elettrico non omogeneo.

Osservazione della nanotopografia e del potenziale senza DNA topography Kelvin Probe potential