Trasformata di Fourier F(t) F(n)

The NMR Experiment z y x M B1 90° t wI I t To have a spin transition, a magnetic field B1 , oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium z y x M B1 90° t wI I t The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID.

FT relax. Preparation Detection x y z t2 w0

FOURIER TRANSFORMATIONS F(n)=d(n0) F(n)=At(sinpvt)/pvt centered at n0 F(t)=exp(-t/T2) F(n)=T2/1+(2pnT2)2 -i 2pn(T2)2/1+(2pnT2)20 F(t)=exp(-t/T2)exp(i2pnA) F(n)=T2/1+(2p(n-nA)T2)2 -i 2p (n-nA)(T2)2/1+(2p (n-nA) nT2)20 FOURIER TRANSFORMATIONS

The FT allows to determine the frequency content of a squared function Why bother with FT? FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function (deconvolution). In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum) The FT allows to determine the frequency content of a squared function

A “real” F.I.D.

Pulse! -y -y The rotation of magnetization under the effect of 90° pulses according to the convention of Ernst et al.. -y -y -y -y -y -y -y y

n=1/t t n=-1/t

Signal to noise

Signal to noise Scans S/N 1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00

I parametri NMR Le costanti di accoppiamento Il rilassamento Il chemical shift Le costanti di accoppiamento La intensità dei segnali Il rilassamento

Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento

Costanti di accoppiamento

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare 2J 3J 3J

Accoppiamento scalare 1H

Accoppiamento scalare 1H

Accoppiamento scalare b b a a 13C 1H S I

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare omonucleare 3J HNHa 2J HbHb

N

Importante 3J dipendono dall’angolo diedro INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE PER RISOLVERE LE STRUTTURE

Costanti di accoppiamento in sistemi uniformemente arricchiti in 13C ed in 15N

Costanti di accoppiamento The scheme of 1J scalar couplings

Rilassamento

It can be observed directly in the FID (linewidth) T1 and T2 T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. This can only be observed if a final 90° pulse is applied to rotate the magnetization from the z axis to the xy plane. The intensity of the overall magnetization on the z axis is related to the overall energy of the system . i.e. the populations of ground and excited states The intensity of the magnetization on the xy axis is related to the rate of dephasing of the magnetization. T2 describes the time evolution of magnetization in the xy plane, where acquisition takes place. It can be observed directly in the FID (linewidth)

x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x DE x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse E DE x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x B1 p x A Pulse E DE z B0 -y B1 x

Rilassamento Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio Rilassamento T1 La constante di velocità con cui la magnetizzazione ritorna all’equilibrio

T1 T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. Related to the overall energy of the system The populations of ground and excited states

x -y z B0 A Pulse p/2 x receiver x -y z B0 A Pulse p/2 x receiver x -y DE z B0 -y B1 x

Rilassamento Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio Rilassamento T2 La constante di velocità con cui la magnetizzazione scompare dal piano xy My=exp(-t/T2)

T2 T2 describes the time evolution of magnetization in the XY plane. In addition to the exchange of energy with the environment, nuclei exchange energy one with another. This does NOT affect the energy of the system but contributes to relaxation T2 is alwayes shorter or equal to T1. It can be observed directly in the FID (linewidth)

z y x M B1 90° t wI I t

The NMR spectrum FID Spectrum The Fourier Transform of the FID provides the NMR spectrum Spectrum ½ Fmax(w) wI w1 w

Da ricordare INOLTRE…… La larghezza di riga di un segnale dipende dal valore del tempo di rilassamento T2. Tanto piu’ T2 é lungo, ovvero tanto piu’ il sistema impiega tempo per tornare allo stato di equilibrio, tanto piu’ la riga NMR é stretta. Una riga stretta permette al segnale di essere osservato con maggiore accuratezza INOLTRE……

Da ricordare Se un segnale ha un T2 molto piccolo, sarà impossibile osservare gli accoppiamenti scalari perché il sistema rilassa “durante” la osservazione dell ‘effetto.

Costante di accoppiamento scalare 2 spin sono accoppiati per effetto di una interazione elettronica, ovvero per effetto di un legame chimico Questi effetto è generalmente osservabile per nuclei che distano fino a 3 legami sigma. Il fenomeno dell’accoppiamento scalare si esprime attrvaerso una constante di accoppiamento J Es HN-Ha 3J = 3-10 Hz LA costante di accoppiamento scalare ha come effetto la formazione di un doppietto. Ovvero ogni spin non appare come un singolo picco ma come un doppietto, le cui componenti sono separate in Hertz, dalla costante di accoppiamento 3-10 Hz

Accoppiamento scalare e rilassamento T2 La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2. In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata. Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto. In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili

Accoppiamento scalare Accoppiamento dipolare

Accoppiamento dipolare Reference experiment Saturation of signal S e Difference experiment

Accoppiamento dipolare A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia L’accoppiamento DIPOLARE ha a che vedere con il rilassamento lungo l’asse z, quindi con il rilassamento T1

Accoppiamento dipolare A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che sono vicino nello spazio

Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND) E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendenti Porta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE) E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loro Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

Through space AND throuhg bonds Through bond