Protein ubiquitination Passmore, and Bardford, Biochem J, 2004 Pickart, Cell, 2004 Brzovic and Klevit, Cell Cycle, 2006 Hochstrasser, Cell, 2006 Protein ubiquitination: regulatory process influencing several aspect of eukaryoyic cell biology Polyubiquitin (polyUb) chain: link ε-amino group of a Lys of one Ub to the C-terminal carboxyl group of the next Ub in the chain E1-E2-E3 responsible for activating and transferring Ub to proteins Fundamental mechanisms of Ub-chain assembly and of E1-E2-E3 regulation still not clearly understood

Ubiquitin like proteins (Ubls) 8-20 kDa Ub 76 aa Globular domain (4βstrands in a antiparallel βsheet +αhelix) + flexible C- terminal terminating with a gly 7 Conserved lysine residues in Ub N.B. ISG15: ha due domini Ubl Di-Ubiquitina Ogni Ubl ha il suo set di E1-E2-E3

E2: Ub-conjugating enzymes Michelle et al., J Mol Evol, (2009) Ye and Rape, Nat Rev Mol Cel Biol (2009) Identification of phosphorylations by Cdks and CK2 kinases affecting E2 activity Cys forms a thiolester bond to C-terminal Gly of Ub Asn stabilizes oxyanion transition state E1 E3/E3 Multi-domain E2 classification in 17 familes reflecting structural organization of cat. dom.

B_LEU8 A_ILE44 B_ILE44 B_VAL70 A_VAL70 A_LEU8 B_Cterm Legame isopeptidico polyUb crossilinkata by K48 sono segnale universale per la degradazione da proteasoma Adottano una CONFORMAZIONE CHIUSA in cui L8, I44 and V70 (patch idrofobico sulla superficie di una singola molecola di Ub) sono sequestrati allinterfaccia tra due molecole di Ub adiacenti K48-linked polyUb Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K48 via NMR o X- ray e una struttura X-ray della tetra- polyUb crosslinkata via K48

Tetra-Ubiquitina crosslinkata K48 Strutture cmq dinamiche in soluzione – alcuni di questi residui potrebbero diventare accessibili per diretta interazione con fattori di riconoscimento For example, does linkagespecific recognition arise from differential display of the events, ubiquitin (Ub) is engaged as a signaling molehydrophobic surfaces or from the presence of novel cule in the form of different polyubiquitin (polyUb) linkage-specific surfaces? chains. PolyUb chains are formed by making isopep- hHR23a (human homolog of yeast Rad23a

K63-linked polyUbpolyUb crosslinkata via K63 agisce come segnale regolatorio piuttosto che degradativo in molti pathway, Adotta conformazione estesa in soluzione senza contatti diretti tra patch idrofobici Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K63 via NMR o X- ray e una struttura X-ray della tetra- polyUb crosslinkata via K63

G76 K63 K48 Hydrophobic patch Monomeric Ub

Come conseguenza a queste differente in conformazione, il segnale di riconoscimento presentato dalle due tipologie di catene è molto diverso. Differenti modalità di interazione con gli UBA-2 domain (di hHR23a). UBA-domain sono domini di legame per Ub – LUBA domain di hHR23a è coinvolto nella modulazione dellinterazione tra catene di poliUb e proteasoma (alta affinità per catene poliUb linkate via K48) IL RICONOSCIMENTO SPECIFICO DI UNA DELLE DUE CATENE HA ORIGINE DA UN DIVERSO MODO DI ESPRRE LE SUPERFICI IDROFOBICHE O DALLA PRESENZA DI NUOVI PATCH DI INTERAZIONE SULLA SUP. DELLE DUE CATENE? Varadan R et al. 2005, Mol Cell, 18,

Non-canonical PoliUb chains K48 K63 G76 Hydrophobic patch K33 K29 K11 K6 K27 Nessuna di esse isolata finora in studi in vitro \ Lo studio delle catene non canoniche importante per: -Chiarire i meccanismi molecolari con cui avviene riconoscimento di specifiche catene di poliUb - Capire se solo le catene linkate da K48 o anche altre permettono una struttura globulare stabilizzata da interazioni non covalenti tra molecole di Ub adiacenti - La conformazione estesa di catene linkate via K63 come hp da Varadan et al. è dovuta a vincoli sterici che prevengono diretto contatto tra i patch idrofobici di due unità di Ub