I metodi RFLP SSCP/DGGE/TGGE Ibridazione con sonde oligonucleotidche Sequenziamento DNA microarrays Pyrosequencing Preceduti da amplificazione Eventuale clonaggio

Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP)

RFLP

Prodotto della PCR delle sequenza di interesse Purificazione e quantificazione Digestione con l’enzima scelto (concentrazione, tempo, temperatura) Elettroforesi in gel di agarosio Digestione con più enzimi di restrizione Confronto di amplificati di ceppi diversi

SSCP Normale Mutato Gel Singoli filamenti Forme differenti Denaturazione A C Singoli filamenti Forme differenti per la presenza di mutazioni T G A C Gel Mobilità differente Mutazione

SSCP Sensibilità: Parametri: 70-95% mutazioni (<200 pb) Temperatura Concentrazione del tampone Concentrazione di acrilamidde Presenza di additivi Marcatori

DGGE/TGGE Diversa migrazione elettroforetica del singolo filamento In gradiente di denaturazione chimico In gradiente di temperatura

DGGE Purificazione del prodotto della PCR Determinazione del profilo di melting e del gradiente di denaturazione Formula di Fodde e Losekoot % di denaturante=(3,2xTm)-182,4 Clamp

DGGE

DGGE Vantaggi Svantaggi Alta sensibilità Sonde radioattive: NO Possibilità di ottimizzare il sistema Svantaggi Tempi per la messa a punto del sistema Clamp Possibilità di ottimizzare il sistema Dimensioni dei frammenti (max 500 pb) Localizzazione mutazione: NO

Sequenziamento Metodo di Maxam e Gilbert Limiti del Metodo Scarsa riproducibilità Materiale radioattivo Sequenze brevi

Sequenziamento Metodo di Sanger Limiti del Metodo Scarsa riproducibilità Materiale radioattivo Sequenze brevi

Marcatura Fluorocromo dell’infrarosso Fluorocromi : fluoresceina, Texas red, ecc.

Sequenziatori automatici Modulo elettroforetico Raggio laser Fotodiodi Piastra termostatica Modulo per l’alimentatore Computer Software Controllo del sistema Analisi ed elaborazione dati

Sequenziatori ABI PRISM 310, 3100, 8000 Tecnologia per il sequenziamento automatico in elettroforesi capillare Terminatori fluorescenti a trasferimento di energia Cycle Sequencing

Sequenziatori CEQTM2000, 8000 (BECKMAN) Cycle Sequencing Marcatori: ddNTP marcati in fluorescenza Tecnologia dell’elettroforesi capillare

DNA microarrays

“formati”

NanoChip electtronico Each test site is electronically connected to the NanoChip system by a platinum wire. NanoChipTM Molecular Biology Workstation (Nanogen, San Diego, CA, USA) 100 siti testo (pads) array (NanoChip cartridge)

NanoChip elettronico Pad (elettrodi) Connessioni elettroniche

Pyrosequencing: principio (DNA)n +dNTP (DNA)n+1+ PPi polymerase

Analisi dei dati Allineamento delle sequenze Confronto con sequenze di riferimento (banche dati) Elaborazione dei dati NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) EMBL (www.embl-heidelberg.de) Blast, Fasta, Phylip, Neighbor-Joining Method ……………