Terapia Genica E’ un approccio moderno per trattare, curare o in ultima analisi prevenire una malattia cambiando l’espressione di uno o più geni. Può essere applicata a cellule somatiche o a cellule germinali. La terapia genica allo stato attuale è largamente sperimentale. La terapia genica germinale non è ad animali di grossa taglia e all’uomo.

Gene therapy in medicina interna Definizione: modificazione di un fenotipo mediante trasferimento di (un) gene. Notevolmente sviluppata dal punto di vista sperimentale in modelli cellulari ed animali. Relativamente avanzata dal punto di vista clinico.

Cosa è realmente la terapia genica? Per inserire un gene in un sistema complesso bisogna innanzitutto avere un gene. La terapia genica fornisce quindi uno strumento per conoscere meglio le funzioni dei geni e delle proteine da essi codificati.

A cosa serve la terapia genica? Cancro: cellule tumorali, progenitori ematopoietici,T-cells, fibroblasti, cellule muscolari. Disordini ereditari monogenici: cellule epiteliali polmonari, macrofagi, progenitori ematopoietici, epatociti, cellule muscolari. Malattie infettive: cellule T, progenitori ematopoietici, cellule muscolari. Malattie cardiovascolari: cellule endoteliali, cellule muscolari. Artrite Reumatoide: cellule epiteliali sinoviali. Sindrome del tunnel Carpale: cellule nervose.

Sistemi di gene transfer DNA nudo Lipidi cationici Particelle di DNA condensato Gene guns Virus

Dna nudo Funziona meglio in vivo che in vitro. Uso: vaccini. Pro: economico e facilmente maneggiabile. Contro: poco efficiente, breve espressione, non si presta a selettività tissutale, crea infiammazione (CpG non metilate).

Lipidi Cationici Legano il DNA mediante interazioni elettrostatiche (non covalenti) Transitorio Uso: Fibrosi Cistica (entra bene nell’epitelio polmonare) Pro: come il DNA nudo. Contro: bassa efficienza, breve espressione.

DNA condensato I polimeri usati sono: polilisine, oligopeptidi,imine polietileniche. Pro: si presta a future manipolazioni può prababilmente favorire la selettività se usato insieme ad altre tecnologie. Contro: come si fa a far andare il dna nel nucleo (dove deve replicarsi).

Gene Guns Cannoncini che sparano il DNA nudo o nelle cellule (difficile in vivo) o nell’interstizio. E’ un alternativa all’iniezione. Pro: bassa immunogenicità. Sostituirà l’ago nell’iniezione di DNA nudo. Contro: Si può sparare sulla pelle, ma quali altri organi?

Elettroporazione Mediante delle differenze di potenziale (scariche elettriche) si fanno dei buchi sulla membrana citoplasmatica e il DNA entra nelle cellule. Poco applicabile in vivo, in vitro “uccide” molte cellule.

Vettori virali Adenovirus. Retrovirus. Virus Adeno associati (AAV): Parvo virus.

Adenovirus I più efficaci sistemi di gene transfer a disposizione. Oltre 50 sierotipi di AV umani. In G.T: si usano quasi esclusivamente il sierotipo 2 e 5, in più comuni. 36 Kb DS-DNA. >50 polipeptidi divisi in: -E1 fattori di trascrizione. -E2 replicatori genoma virale -E3 Fattori prottetivi immunogeni -E4 replicatore genoma virale First generation: E3 def. Circa 7.5 KB Newer generations: E1,E2/E4.

Promotore CMV. Fegato sito di maggiore uptake. Pro: molto efficaci, elevata e rapida espressione, relativa specificità. Contro: tossici, rapida eliminazione, molti umani sono già sensibilizzati, spesso contaminati.

Retrovirus SS-RNA avviluppato in lipidi, 7-11 KB, si inseriscono nel genoma dopo essere stato retrotrascritto. Si divide in: Onco Retrovirus, Lenti virus, Spuma virus. Infezioni croniche. Ben tollerati dall’ ospite in cui si slatentizzano di tanto in tanto. GAG: proteine strutturali; POL: polimerasi; ENV: proteine di superficie. 83 KB di Dna eterologo che si può inserire nel genoma.

Prolonged transgene expression. Ridotti livelli di espressione. Le proteine di superficie hanno recettori specifici sulle membrane cellulari, per cui entrano più facilmente in alcuni tessuti che in altri. Vengono rapidamente eliminati dal circolo. Molto usati ex vivo, poco usati in vivo.

Virus Adeno Associati (AAV) Parvovirus. Necessitano di un helper. 6 sierotipi, si usa il 2. Non ci sono malattie associati agli AAV. Nel genoma ci sono 2 geni che producono multipli polipeptidi: REP produce prodotti per la replicazione. CAP produce proteine strutturali.

REP permette l’ integrazione nel cromosoma 19. Espressione lenta ma duratura 5.0 KB di spazio. Pro: espressione stabile e duratura. Contro: poco spazio, difficile da produrre su larga scala.

Studi clinici Malattia: Ischemia (Miocardio,Claudicatio intermittens). Gene: VEGF. Transfer: in vivo. Vettore: Dna nudo. Risultati: VEGF è un fattore solubile. L’iniezione di DNA nudo IM conduce all’aumento dei livelli circolanti del fattore induzione della neoangiogenesi. Rivascolarizzazione eterotropa del vaso. Obiezioni: Studio in fase 1, mancano i controlli. Per il miocardio, mancano evidenze angiografiche di rivascolarizzazione, solo evidenze “morfologiche e funzionali” ottenute alla scintigrafia.

Studi di fase I/II per valutare la tossicità 1° studio: Malattia SCID. Gene: ADA. Transfer: ex vivo in T Cell. Vettore: LASN (Retrovirus). Risultato: miglioramento del quadro clinico Obiezioni: scarso numero di pazienti (n=2) assenza di controlli. La terapia tradizionale non fu discontinuata. NIH trial. Telethon study.

Caso Gelsinger Malattia: Iperammonemia. Gete: OTC (Ornithyne Transcarbamylase). Transfer: in vivo, target: il Fegato. Vettore : Adenovirus, replicatio deficient. Risultato: morte per ARDS nell’ ambito di SIDS.

Gene therapy in Hypertension L’ ipertensione è una sindrome (malattia) a trasmissione familiare, ma multifattoriale. Probabilmente più di un gene vi è coinvolto e alcuni geni in certi tipi di ipertensione sono più colpevoli di altri. Si definisce iperteso: Sistolica >140 mmHg. Diastolica > 90 mmHg

Condizioni cliniche che derivano dall’ipertensione Stroke Cardiopatia ipertrofica e poi dilatativa. Cardiopatia ischemica. Arterosclerosi. Insufficienza renale.