Lez 7 Processamento dell’RNA negli eucaroti: RNA splicing ..\Animations\ch12_transcription.html

Fattori per la maturazione e processamento del RNA La CTD fosforilata recluta gli enzimi per il capping e per lo splicing Il capping viene effettuato subito dopo la sua sintesi

RNA factory Gli enzimi per il processamento del DNA sono portati dalla coda CTD della RNA Pol II.

RNA capping Fosfatasi Tre enzimi: Fosfatasi Guanil transferasi Metil transferasi Tre enzimi: Fosfatasi Guanil transferasi Metil transferasi

3’ terminale di mRNA eucariotici Sequenze consenso AAUAAA è riconosciuta da cleavage and polyadenylation specific factor (CPSF) La regione GU-rich da Cleavage stimulation factor F (CstF)

Produzione del 3’ terminale di mRNA eucariotici La sequenza AUAAA è riconosciuta da CPSF, la GU-rich da CstF, poi reclutano altri fattori che tagliano il DNA e viene reclutata poli-A-polimerasi (PAP)

Lo splicing

RNA Processing Esoni introni: esempi di due geni umani

Esempi di splicing alternativo

Sequenze consenso per gli introni

Consensus sequence Un’alte conservazione si trova solo immediatamente all’interno degli introni alle giunzioni presunte. Questo identifica la sequenze di un introne generico come la regola : GU##AG: o GT-AG. I due siti hanno sequenze diverse e definiscono le terminazione degli introni direzionalmente .

Che meccanismo fa in modo che i due siti sono tagliati insieme? Tutti i site 5¢ e 3¢ sites sono funzionalmente equivalenti, ma lo splicing segue delle regole che assicurano che il sito 5¢ è sempre collegato al sito 3¢ che viene dopo nel RNA.

Il meccanismo dello splicing Attacco del 2’OH al 5’ splicing site con formazione del cappio Attacco del 3’OH libero al 3’ splicing site Liberazione del cappio

Meccanismo dello splicing La giunzione a tre vie del cappio

Il branch site nei lieviti è conservato ed la sequenza consenso è UACUAAC.. Il branch site si trova 18-40 nucleotidi a monte del 3 ¢ splice site. gli eucarioti superiori hanno sequenze correlate (cryptic sites) Il ruolo del the branch site è di identificare il 3’ più vicino come bersaglio per collegarlo al 5 ¢ splice site transesterificazione Il primo passaggio è un attacco nucleofilo dal 2 ¢ –OH della A invariante del UACUAAC Nel secondo passaggio, il 3¢ –OH libero dell’esone attacca il legame al 3¢ splice site.

caratteristiche Gli Splice sites sono generici: non hanno specificità per gli RNA individuali, L’apparato dello splicing non è tessuto specifico; Lo splicing avviene solo tra siti 5’ e 3’ dello stesso introne. Lo splicing segue un cammino preferito. la reazione non procede sequenzialmente lungo il precursore.

spliceosoma Il complesso si assembla sequenzialmente sul pre-mRNA, e lo splicing avviene solo dopo che tutti i componenti si sono assemblati Il nucleo e il citoplasma contengono molti piccoli RNA (200-300 bp) Quelli nel nucleo sono chiamati small nuclear RNAs (snRNA); e quelli nel citoplasma small cytoplasmic RNAs (scRNA). lo spliceosome include un 50-60S ribonucleoprotein particle (più grande di quella del ribosoma), con 150 proteine Le snRNPs coinvolte nello splicing sono U1, U2, U5, U4 e U6. Ogni snRNP contiene un solo snRNA e alcune (<20) proteine. Un nucleo strutturale comune per ogni snRNP consiste in un gruppo di 8 proteine, tutte riconosciute da un antisiero autoimmune chiamato anti-Sm

Gli snRNAs sono necessari per lo splicing I cinque snRNPs coinvolti nello splicing sono U1, U2, U5, U4, e U6. Insieme ad altre proteine addizionali, gli snRNPs formano lo spliceosome. Tra esse: U2AF (U2 Auxillary Factors) e BBP (branch point Binding Proteins). Le proteine agiscono in modo coordinato con la formazione di tre complessi intermedi

Splicing steps U1 snRNP inizia lo splicing legandosi allo 5¢ splice mediante una reazione di appaiamento RNA-RNA. Si forma il complesso E (early) che contiene U1 snRNP legato allo 5¢ splice site, la proteina U2AF legata al tratto di pirimidine tra il branch site e allo 3¢ splice site, e le SR proteine che collegano U1 snRNP a U2AF. (Le SR si legano ai siti di splicing degli esoni: ESE =exonic splicing enhancer)

complesso E: early presplicing contiene U1 snRNP legato al 5’splice-site U2AF legata a Py tract ed al 3’ splice-site Questa recluta BBPche si lega al branch site. Quindi tutti i siti sono riconosciuti

Complesso A U2 sostituisce BBP al branch site L’appaiamento tra i due RNA spinge in fuori la A del Branch site, che diventa disponibile all’attacco

Complesso B Il complesso A si riarrangia e si avvicinano i 3 siti di splicing Questo avviene con l’ingresso della tripla U4/U5/U6 Poi U6 sostituisce U1 al 5’splice -site

Complesso C U4 viene rilasciato, così U2 e U6 possono interagire con appaiamento degli RNA Questa conformazione produce il sito attivo, che sembra essere composto principalmente da RNA. il 5’Splice site è avvicinato al branch site (U2-U6). U5 avvicina i siti 3’ e 5’. Il cappio e le SnRNP vengono rilasciati

RNA splicing Passaggi dello spliceosoma Complesso E (early) A: (Branch site) B1: (spliceosoma completo) B2: U1 è rilasciato e si ha un riarrangiamento C1: U4 è rilasciato ed inizia la catalisi C2: sito 3’ tagliato e gli esoni ligati animazione A B C

Accoppiamento RNA-RNA Il sito al 5’ è riconosciuto prima da U1 e poi da U6. U6 e U2 indirizzano la catalisi.

introni Self-splicing di gruppo II. Rari introni di organelli. Dimensione di 400-1000 nt Lo splicing non necessita della presenza di proteine Il meccanismo è simile a quello dello spliceosoma

introni Self-splicing di gruppo I. Rari introni di eucarioti, rRNA o organelli. Dimensione di 400-1000 nt Una G si lega ad una tasca ed attacca il 5’splicing site Hanno una sequenza di guida interna che si appaia alla sequenza del sito al 5’. Lo splicing non necessita della presenza di proteine

Splicing alternativo Nel gene DSCAM di drosofila gli ipotetici mRNA alternativi sono circa 38,000

Errori di splicing Uno esone può essere saltato Si possono usare siti criptici

Accuratezza dello splicing Il sitema di splicing è sulla CTD della RNA polimerasi ed interagisce sequenzialemente con l’RNA neosintetizzato Le proteine SR (ricche in Ser e Arg) si legano a sequenze esoniche dette Exonic splicing enhancer, ESE. Queste reclutano U2AF al 3’ ed U1 al 5’

Exon definition hypothesis

Splicing alternativo La troponina dà luogo a due forme con due esoni diversi: o il 3 o il 4 In genere le alternative possono essere costitutive o regolate

Splicing alternativo Ci sono almeno 5 modi diversi di fare splicing alternativo

Esempio di Splicing alternativo costitutivo L’antigene T del virus della scimmia SV40 ha 2 5’ splicing site alternativi (5’SST e 5’sst). 5’sst da luogo a un trascritto più lungo con uno stop codon (t-antigen) 5’SST and un trascritto più corto e peptide più lungo (T-ag) Il rapporto tra i due è regolato dai livelli delle proteina di splicing SF2/ASF

Esempio di Splicing alternativo regolato Repressori: intronic-exonic splicing silencers (ESS o ISS). Si legano a hnRNP (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) e non hanno il dominio SR per il legame a U1 o U2AF. Bloccano i siti di enhancer Gli attivatori (ESE o ISE) riconoscono una sequenza specifica e col dominio RS reclutano i fattori di splicing

hnRNPI è un inibitore dello splicing Nasconde gli esoni con due meccanismi unendo le regioni fiancheggianti l’esone, coprendo cooperativamente l’esone.

Spliceosoma minore Negli eucarioti superiori esiste una forma più rara di spliceosoma che ha siti di riconoscimento diversi: Spliceosoma AT-AC (normale GT-AG) Il meccanismo di base è analogo, ma le proteine sono in parte distinte

Spesso gli esoni codificano domini strutturali con funzioni distinte. (Es: DNA-binding e dimerizzazione)

Gli esoni: ruolo evolutivo Molti geni si sono evoluti duplicando egli esoni Esoni simili si possono trovare in proteine molto diverse

Esempio: enzimi che modificano la cromatina Y= lievito, W= verme, F= mosca, H= uomo

RNA editing Rappresenta un altro modo per modificare la sequenza di un mRNA deamminazione sito- specifica (CU o A Inosina) Inserzione o delezione di U diretta da RNA guida

Esempio di deamminazione sito-specifica Gene dell’apolipoproteina-B umana. La deamminazione, introduce uno stop codon, e quindi una proteina troncata

Editing con inserzione di U, mediato da RNA guida Forma trovata nel mitocondrio di tripanosoma Vengono aggiunte delle U, modificando il frame di lettura. I RNA guida (gRNA) hanno un’ancora di attacco al 5’, la regione di editing ed un tratto poli-U al 3’.

Meccanismo Il gRNA si attacca con l’ancora Induce la formazione di anse sul mRNA da modificare Taglio endonucleasico Inserimenti di U da parte di uridil-transferasi 3’ terminale (TUTasi) Poi la Ligasi. Il tratto PoliU potrebbe aumentare la complementarietà dell’attacco. Lo stesso gRNA può modificare siti diversi

Il trasporto del mRNA mRNA maturo (con capping, splicing, PoliA e proteine aggiunte) viene rilasciato dal nucleo con un meccanismo regolato Attrevarso il poro nucleare, che usa la GTPasi Ran.