Nucleotidi e Acidi Nucleici Nucleosidi Nucleotidi Funzioni biologiche dei nucleotidi Struttura di DNA e RNA Concatenazione e appaiamento dei nucleotidi Lo scheletro degli acidi nucleici La forme B, Z, etc. Analisi tridimensionale (CHIME)

Componenti degli acidi nucleici Gli acidi nucleici sono macromolecole lineari, a catena, isolate per la prima volta dai nuclei delle cellule. L’idrolisi completa di un acido nucleico fornisce una miscela di BASI ETEROCICLICHE (quattro tipi) ACIDO FOSFORICO ed uno ZUCCHERO.

Componenti degli acidi nucleici

2,4-DIOSSI-5-METILPIRIMIDINA 4-AMMINO-2-OSSIPIRIMIDINA Basi Eterocicliche Le basi eterocicliche presenti negli acidi nucleici appartengono a due classi: PURINE ADENINA 6-AMMINOPURINA GUANINA 2-AMMINO-6-OSSIPURINA PIRIMIDINE TIMINA 2,4-DIOSSI-5-METILPIRIMIDINA CITOSINA 4-AMMINO-2-OSSIPIRIMIDINA URACILE 2,4-DIOSSI-PIRIMIDINA

BASICITA’ DELLE AMMINE (Kb) METILAMMINA (ALCHILICA) CH3NH2 4.5 x 10-4 ANILINA (AROMATICA) -NH2 4.2 x 10-10 PIRROLO NH2 2,4 x 10-14 PIRROLIDINA NH2 1 x 10-3 PIRIDINA NH2 2.3 x 10-9 PIPERIDINA NH2 2 x 10-3

uracile tautomeria lattamico-lattimica O H O O H H N N N H O N O N O N forma doppio-lattimica forma lattimica forma lattamica

Forme tautomeriche

Forme tautomeriche

Monosaccaridi degli Acidi Nucleici Gli zuccheri presenti negli acidi nucleici sono 2-deossi-D-ribosio (DNA) e D-ribosio (RNA)

Nucleosidi Il legame tra basi eterocicliche e ribosio forma i diversi Nucleosidi Il legame è di tipo b-N-glicosidico tra il Carbonio anomerico del ribosio e l’N 9 delle purine o N1 delle pirimidine Il legame può avere due orientazioni: Syn e Anti. Anti è predominante Hanno numerosi gruppi polari e sono solubili in acqua. Sono facilmente idrolizzabili da soluzione acquose di acidi. syn anti

Base Zucchero Nucleoside Nucleosidi Base Zucchero Nucleoside DNA Adenina 2-deossi-D-R. 2’-deossiadenosina Guanina 2-deossi-D-R. 2’-deossiguanosina Citosina 2-deossi-D-R 2’-deossicitidina Timina 2-deossi-D-R. 2’-deossitimidina RNA Adenina D-R. Adenosina Guanina D-R. Guanosina Citosina D-R. Citidina Uracile D-R. Uridina

Nucleotidi I nucleotidi sono ESTERI FOSFATO dei nucleosidi. Il sito di fosforilazione è spesso l’ossidrile al 5’ del ribosio, ma può essere anche quello in 3’ Possono essere mono- di- e tri-fosfati (Es.: TMP, TDP, TTP.) I di- e tri-fosfati sono legati da legame anidridico, stabile e ad alta energia TMP

Funzioni dei nucleotidi Unità strutturali degli acidi nucleici Deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato (ATP - GTP) Mediatore di processi cellulari (cAMP) Parte di coenzimi (NADH, FAD, CoA ) Intermedi di reazioni sintetiche (S-Adenosilmetionina)

ATP-ADP-AMP L'adenosina è presente come fosfato in varie forme. Il 5'-monofosfato, difosfato e trifosfato, così come il monofosfato 3',5'-ciclico, sono intermedi chiave in numerosi processi biologici. L'ATP contiene due legami di anidride fosforica ed ha la caratteristica di liberare quantità notevoli di energia quando si idrolizza ad ADP e, successivamente, ad AMP. Sono queste le reazioni che forniscono l'energia necessaria per altre reazioni biologiche. Ciclo dell’ATP e Accoppiamento reazioni endoergoniche con reazioni esoergoniche

Derivati dell’AMP Derivati di GMP Il più comune è 3'-5'- adenosina monofosfato ciclico, cAMP E’ prodotto dall’enzima adenilato ciclasi È un secondo messagero per la trasduzione del segnale dalla superficie cellulare all’interno della cellula. E’ usato dalla protein-chinasi cAMP dipendente (PKA) per fosforilare molte proteine. Derivati di GMP La forma ciclica di GMP (cGMP) E’ un secondo messaggero analogo a cAMP, ma con funzioni distinte

S-adenosilmetionina S-adenosil metionina è una forma attivata di metionina per la donazione di metili

NAD, FAD, CoA Coenzimi importanti contengono nucleotidi nella loro struttura: Coenzima A, nella cui struttura è presente l'ADP, un agente biologico capace di trasferire i gruppi acilici, che ha un ruolo chiave nel metabolismo dei grassi. Il nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) ed il flavina adenina dinucleotide (FAD) sono coenzimi che partecipano a numerose reazioni biologiche di ossido-riduzione. FAD NAD CoA

Analoghi sintetici dei nucleotidi Possono inibire alcuni enzimi e interferire con la sintesi del DNA Esempi sono: 6-mercaptopurina, 5-fluorouracile, 5-iodo-2'-deossiuridina and 6-tioguanina usati come anti-tumorali AZT (azidotimidina) and ddI (dideossinosina) per HIV

Polinucleotidi I polinucleotidi si formano dalla condensazione di due o più nucleotidi tra il fosfato legato al 5’-OH del ribosio di un nucleotide ed il 3’-OH del ribosio dell’altro con eliminazione di H2O ogni fosfato ha ancora un protone acido che, a pH 7, è ionizzato (carica negativa sull'ossigeno). Se il gruppo fosfato fosse indissociato, la sostanza sarebbe un acido; polinucleotidi biologici = acidi nucleici. Il legame fosfodiestereo è direzionale, e la sequenza va da 5’ 3’ La sequenza delle basi definisce la molecola 5’-pGpApTpC-3’ I polinucleotidi biologici sono l’ACIDO DEOSSIRIBONUCLEICO (DNA) e l’ACIDO RIBONUCLEICO (RNA)

Legame fosfodiesterico I mono- e di-esteri del fosfato (pKa = 2) sono carichi negativamente a pH 7, e ciò li rende meno suscettibili all’attacco nucleofilo, e quindi all’idrolisi. L’alta densità di carica negativa stabilizza i trifosfati La carica riduce la diffusione attraverso le membrane dei nucleotidi Ester Rate of Hydrolysis Relative Rate Ethyl Acetate CH3CO2C2H5 1.0*10-2 5*106 Trimethyl Phosphate (CH3O)3PO 3.4*10-4 2*105 Dimethyl Phosphate (CH3O)2PO2(-) 2.0*10-9 1. Ester Hydrolysis at 35º C and pH 7

Il DNA Acido nucleico costituito da deossinucleotidi concatenati tramite legame fosfodiestereo. La sequenza delle basi in direzione 5’ 3’ determina la struttura PRIMARIA dell’acido nucleico L’uridina non è mai presente nel DNA, mentre la Timidina è specifica. Presenza di basi modificate (metil-citosina)

Perché la timina nel DNA? DNA vs RNA Perché la timina nel DNA?

Struttura secondaria del DNA modello Watson-Crick Elica destrorsa costituita da due catene polinucleotidiche antiparallele Le basi sono all’interno dell’elica allineate ad angolo retto con l’asse dell’elica (deossiribosio e fosfato all’esterno) Le due catene sono unite da ponti idrogeno tra purine di una catena e pirimidine dell’altra G-C formano 3 legami idrogeno A-T formano 2 legami idrogeno

accoppiamenti

Chimica delle basi e mutazioni del DNA Forme tautomeriche

Chimica delle basi e mutazioni del DNA

Chimica delle basi e mutazioni del DNA: deamminazione

Appaiamenti modificati Adenina + HNO2  ipoxantina La ipoxantina si appaia con Citosina

Agenti Alchilanti Composti (solitamente) elettrofili che accettano elettroni dai centri nucleofili di composti organici (DNA). -monofunzionali o bifunzionali -Sede di attacco: azoto delle basi (N7 guanina) o ossigeno; ossigeno dei legami fosfodiestere Esempi: Monofunzionali: -EMS (etilmetansulfonato). -Nitrosammine. -Nitrosourea. Bifunzionali: - mostarde azotate. -mitomicina. -Cis-platino.

Alchilazione da Etilmetansulfonato

Analoghi Delle Basi Alogeno-derivati dell’uracile Esempio: 5-bromo-uracile. Bromo al C-5 aumenta la proporzione del raro tautomero enolico

Appaiamento alternativo di 5-bromouridina

Conformazioni del DNA forme A, B e Z. IL modello della doppia elica di Watson-Crick è in realtà una semplificazione. Le conformazioni ad elica del DNA vengono attualmente classificate in tre famiglie generali: forme A, B e Z.

Proprietà di DNA-A, -B e -Z

B-DNA Forma predominante = regolare elica destrorsa di Watson e Crick, con basi perpendicolari all’asse dell’elica Si ottiene quando il DNA è completamente idratato (in vivo) 10 basi per giro completo dell’elica 3,4 Ǻ = distanza tra due basi 36° = angolo rotazione tra due basi La superficie esterna mostra due solchi separati dalla catena fosfato-ribosio: solco maggiore (major groove) e solco minore (minor groove). Il “pavimento” di questi solchi è costitutito dai fianchi delle basi azotate interazioni sequenza specifiche DNA-Proteine.

Major e Minor Groove Nel B-DNA: asse dell’elica attraversa il centro di ciascuna base, posta perpendicolarmente ad esso. attacco delle basi alla catena ribosio-fosfato è asimmetrico Solco maggiore e minore hanno profondità simile, ma diversa ampiezza.

A-DNA Ottenuto in condizioni di disidratazione non fisiologica (sembra non esistere in vivo) Elica destrorsa con catene antiparallele 10.9 basi per giro completo dell’elica 33,1° rotazione angolare tra due basi adiacenti 2,9 Ǻ = distanza tra due basi adiacenti

Z-DNA Struttura trovata in sequenze caratterizzate da alternanza di G e C. Probabile anche in vivo Elica è sinistrorsa e la dorsale zucchero-fosfato segue un andamento a zig-zag. Guanidina in posizione syn. Major groove molto superficiale e minor molto stretto.

Proprietà termiche Se il DNA è portato ad alte temperature i legami H diventano instabili e le due catene si separano: DENATURAZIONE TERMICA. Le sequenze ricche di A e T si denaturano più facilmente di quelle ricche in G e C La temperatura alla quale il 50% del DNA è denaturato è detta Tm (Melting Temperature) dipende dalla sequenza (solvente e ioni) Dopo raffreddamento le basi si riappaiano: rinaturazione, ibridizzazione o annealing

Principi di interazione DNA-Proteine Nel B-DNA le zone di possibile interazione specifica con proteine sono i “pavimenti” dei solchi maggiori. Gli atomi di N e O ed i gruppi metile delle basi possono interagire con le catene laterali delle proteine in modo specifico.

Analisi del DNA Cromatografia Elettroforesi CHIME

RNA Gli acidi ribonucleici (RNA) differiscono per tre aspetti importanti dal DNA: (1) lo zucchero è il D-ribosio, (2) una delle quattro basi eterocicliche è l'uracile (al posto della timina) (3) molecole di RNA sono costituite da un unico filamento, sebbene possano essere presenti zone a elica, dovute al ripiegamento della catena su se stessa. Il D-ribosio, lo zucchero dell'RNA, è diverso dal 2-deossi-D-ribosio, lo zucchero del DNA, in quanto ha un ossidrile sul C-2. Per il resto i nucleosidi e i nucleotidi dell'RNA hanno strutture simili a quelli del DNA.

Effetto del 2’OH Il gruppo è ingombrate ed interferisce con la struttura della doppia elica RNA va incontro ad idrolisi spontanea 100 volte più velocemente di DNA

Struttura del RNA Il ripiegamento della catena può esser descritto da 7 angoli di torsione (a, b, g, d, ...) Una struttura comune è quella a forcina (hairpin)

RNA Le cellule contengono tre tipi principali di RNA: l'RNA messaggero (mRNA), che presiede alla trascrizione del codice genetico e funge da matrice ella sintesi proteica; l'RNA transfer (tRNA), che trasporta al ribosoma gli amminoacidi in forma attivata, pronti per la formazione dei legami peptidici; l'RNA ribosomiale (rRNA), che assomma a circa l'80% dell'RNA cellulare totale (tRNA=15%; mRNA=5%) e che è il principale componente dei ribosomi

FINE tRNA 1 tRNA 2

ATP-ADP-AMP-cAMP

ATP (1)

ATP (2) Produzione di ATP: Fosforilazione ossidativa Glicolisi Ciclo di Krebs

ATP (3) + =

FAD Sede della RIDUZIONE

FAD Forme ossidata e ridotta del FAD Flavin adenin dinucleotide H O H 3 N N H C N O N H 3 2 H H C H N N H C O H N H C O H N H C O H O FAD H C O P O P O C H 2 O H O - O H O H Flavin adenin dinucleotide

NAD ( dinucleotide) nicotinammide adenin + 2H+ + 2e- - 2H+ - 2e- P + + 2H+ + 2e- - 2H+ - 2e- Forme ossidata e ridotta del NAD ( dinucleotide) nicotinammide adenin NAD

Coenzima A

Produzione di cAMP

cAMP come secondo messaggero ORMONI: primi messaggeri (tra una cellula e l’altra) cAMP: secondo messaggero (all’interno delle cellule) cAMP

DNA

Polinucleotidi

Doppia elica (1)

Negli acidi nucleici due filamenti polinucleotidici sono associati in una struttura a doppia elica

Le basi puriniche e pirimidiniche sono invece all’interno della doppia elica Il ribosio ed i gruppi fosfodiesterei sono disposti all’esterno della doppia elica

Doppia elica (2)

Appaiamento basi

Appaiamento basi (2)

Conformazioni

B-DNA (1)

B-DNA (2)

Major e Minor Groove (1)

Major e Minor Groove (2)

Major e Minor Groove (3)

Z-DNA (1)

Z-DNA (2)

Denaturazione termica

DNA-Proteine (1)

DNA-Proteine (2)

DNA-Proteine (3)

RNA

mRNA

tRNA (1)

tRNA (2)

rRNA

RNA messaggero Hanno strutture tridimensionali (3D) complesse

Adenosina-5’-trifosfato ATP 6 7 1 5 8 Legame fosfoestereo 2 9 4 3 Legame b-N-glicosidico 5’ 4’ 1’ Legami fosfoanidridici 3’ 2’ Adenosina-5’-trifosfato

Meccanismo di azione: interagiscono direttamente con il DNA formando un legame covalente grazie ad una reazione di alchilazione tra la forma attivata del farmaco (un carbocatione , elettrofilo) e le basi azotate del DNA (strutture nucleofile). Il principale bersaglio di questa reazione è l’N in posizione 7 della guanina. La base , riconosciuta anomala , viene escissa dalle endonucleasi , mentre l’integrità del filamento è ricostituita dall’enzima ligasi. Tuttavia, gli alchilanti bifunzionali, possono formare dei legami a ponte(cross-link) tra due filamenti del DNA o anche all’interno dello stesso filamento provocando la rottura completa della molecola di DNA oppure un blocco della trascrizione e della duplicazione. In generale gli alchilanti appartengono al gruppo dei farmaci ciclo aspecifici , quindi danneggiano ogni cellula in qualsiasi fase essa si trovi ma la fase più suscettibile rimane comunque la fase S del ciclo cellulare, quando alcuni il DNA è parzialmente svolto e più accessibile. Quindi il bersaglio degli alchilanti sono le cellule in replicazione che muoiono in fase G2.