STRESS OSSIDATIVO Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad un’aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.

STRESS OSSIDATIVO Sbilanciamento dell’equilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti nell’organismo a favore dei pro-ossidanti PRO-OSSIDANTI ANTIOSSIDANTI

Specie reattive  Difese antiossidanti  Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi pro-ossidanti e processi antiossidanti (Sies, 1991) Specie reattive  Difese antiossidanti  Radiazioni, farmaci, metalli pesanti Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà Infezioni ed altre malattie Ridotta assunzione e/o diminuita sintesi e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti Danno cellulare Invecchiamento precoce Malattie cardiovascolari Altre malattie Demenza, M. di Parkinson Infiammazioni, tumori Danno tissutale Danno d’organo Danno sistemico

L’ossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come Reazioni del metabolismo dell’ossigeno L’ossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come O::O In realtà alla temperatura corporea l’ossigeno è un biradicale .O : O. con due elettroni spaiati, ciascuno localizzato su un orbitale diverso. A causa quindi della sua configurazione elettronica l’ossigeno va incontro a riduzione monovalente ( 1 e-)

Quando un ossigeno guadagna un elettrone, si trasforma in radicale anione superossido, O2- . L’aggiunta di un secondo elettrone (insieme con due protoni) trasforma quest’ultimo in perossido di idrogeno, H2O2. Il perossido non è un radicale ma guadagna facilmente un altro elettrone dando spazio ad un radicale idrossilico, OH che è una particella chimica molto attiva che inizia facilmente reazioni a catena incontrollabili.

Nei sistemi biologici, i radicali liberi dell’ossigeno o ROS (Reactive Oxygen Species) vengono generati ed eliminati continuamente. I principali ROS sono: O2- (anione superossido), O2H (radicale idroperossido); OH (radicale idrossilico); NO (monossido d’azoto); ONOO- (anione perossinitrito). Esistono altre molecole, quali H2O2 (perossido d’idrogeno) e HOCl (acido ipocloroso) che pur non essendo radicali di per sé, producono facilmente il radicale idrossilico, altamente reattivo

Le specie chimiche reattive, radicaliche, agiscono come ossidanti + Radicale (ossidante) A Nuova molecola (ridotta, stabile) Molecola bersaglio (doppio legame C-C) C Nuovo radicale (ossidante) Elettrone spaiato OSSIDAZIONE L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello stress ossidativo

REAZIONI DI RADICALI LIBERI INIZIO: formazione di radicali liberi PROPAGAZIONE: i radicali liberi reagiscono con altre molecole per produrre altri radicali liberi TERMINAZIONE: i radicali liberi reagiscono tra loro per formare molecole

REAZIONI DI RADICALI LIBERI CH4 + Cl2 CH3Cl + HCl

INIZIO PROPAGAZIONE Cl  Cl  Cl  Cl  Richiesta luce UV per questo primo stadio Formazione di radicali liberi PROPAGAZIONE La propagazione è caratterizzata da reazioni in ciascuna delle quali si consuma un radicale libero e se ne forma un altro Non è richiesta luce Ogni reazione produce radicali liberi

Molecole Radicali liberi H Cl  + H  C  H H  Cl  H +  C  H Radicali liberi H H  C  + Cl  Cl H  H  C  Cl + Cl 

TERMINAZIONE La terminazione è caratterizzata dalle reazioni dei radicali liberi per produrre molecole H Cl  +  C  H H  Cl  C  H Cl  + Cl   Cl  Cl H H  C  H  C  H H H H H  H  C  C  H H H

Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO Specie chimica Formula Classe Specie chimica Formula Classe Ozono O3 Non radicale Ossido nitrico NO Radicale Anione superossido O2 Radicale Acido nitroso HNO2 Non radicale Ossigeno singoletto 1O2* Radicale (?) Tetrossido nitrico N2O4 Non radicale Perossido di idrogeno H2O2 Non radicale Triossido nitrico N2O3 Non radicale Radicale ossidrile HO Radicale Perossinitrito ONOO- Non radicale Radicale alchilico R Radicale Acido perossinitroso ONOOH Non radicale (Alchill-)perossil radicale ROO Radicale Catione nitronio NO2+ Non radicale (Alchil)idroperossido ROOH Non radicale (Alchil)perossinitrito ROONO Non radicale Semichinone (dal Coenz. Q) Q Radicale Acido ipocloroso HOClO Non radicale Fenossile (dalla vitamina E) E-O Radicale Tiile -S Radicale

I ROS vengono prodotti sia attraverso una serie di reazioni catalizzate da enzimi che attraverso reazioni di natura non enzimatica.   I ROS possono essere prodotti anche in seguito ad esposizione a radiazioni ionizzanti, xenobiotici, agenti chemioterapici.

H2O2 + Fe2+ (Cu+ )  Fe3+ (Cu2+) + HO + OH- reazione di Fenton: H2O2 + Fe2+ (Cu+ )  Fe3+ (Cu2+) + HO + OH-   reazione di Haber-Weiss: H2O2 + O2-  HO + OH- + O2 Il perossido di idrogeno in presenza di ioni Fe2 + o Cu2+ reagisce con l’anione superossido prendendo parte alla:

I mitocondri vengono considerati la fonte principale di ROS cellulari poiché i radicali del superossido vengono generati costantemente durante la fosforilazione ossidativa e possono essere convertiti in H2O2 ed altre specie reattive dell’ossigeno Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5% dell’ossigeno non viene completamente ridotto ad H2O, ma forma prodotti intermedi dell’O2 altamente reattivi

Nella cellula, i ROS oltre che nei mitocondri, vengono generati anche in altri compartimenti e da molti enzimi.

Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS Stress ossidativo da modificazioni reattive della superficie cellulare da induzione farmacometabolica da variazioni intracellulari della pO2 da ridotta efficienza del- la respirazione cellulare Citocromo P450 Citocromo b5 Xantina ossidasi Aldeide ossidasi NADPH ossidasi Lipoossigenasi NADH deidrogenasi Citocromo ossidasi NADPH ossidasi Lipoossigenasi NADH deidrogenasi Citocromo ossidasi Xantina ossidasi Aldeide ossidasi Citocromo P450 Citocromo b5

Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi Produzione di ROS dal catabolismo purinico Xantina ossidasi ipoxantina xantina Acido urico H2O + O2 H2O2 O2 O2.

Biosintesi dell’NO Agisce come importante messaggero intra ed inter cellulare regolando molte funzioni: pressione arteriosa, respirazione, coagulazione del sangue ed alcune attività cerebrali. Ha un ruolo determinante nella difesa dalle infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori

MECCANISMI DI PRODUZIONE DI ROS Negli organismi viventi i ROS sono generati nel corso della normale attività metabolica cellulare

A concentrazioni elevate i ROS sono dannosi per l’organismo in quanto attaccano i maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi nucleici, lipidi) partecipando così a processi complessi quali l’invecchiamento e le patologie ad esso correlate.   A concentrazioni moderate i ROS partecipano attivamente ad una varietà di processi biologici complessi, implicati nella normale crescita cellulare quali la trasduzione del segnale, il controllo dell’espressione genica, la senescenza cellulare, l’apoptosi

Effetto dei ROS sulle macromolecole I ROS causano danni ossidativi, chimici alle biomolecole   Il radicale idrossilico OH reagisce con le biomolecole tramite reazioni di sottrazione o addizione di H. Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati  Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate I ROS reagiscono anche con i carboidrati per formare composti dicarbonilici

La matrice cellulare rappresenta uno dei principali target delle specie reattive dell’ossigeno Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo

Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari Cellula normale (senza lesioni) Cellula dopo l’attacco dei ROS Perossidazione di lipidi Modificazioni enzimatiche del DNA Denaturazione di proteine Perossidazione ammi- noacidi e proteine (Per)ossidazione di carboidrati Alterazioni della omeostasi ionica

Effetto dei ROS sulle macromolecole   Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi. Il radicale idrossilico OH sottrae un atomo di idrogeno ad un acido grasso poliinsaturo, iniziando così una catena di reazioni di perossidazione lipidica.    I perossidi lipidici formati in questa reazione vengono degradati per formare dei prodotti caratteristici quali la malonildialdeide (MDA) o l’idrossinonenale (HNE) Questi composti reagiscono con le proteine formando legami crociati e addotti chimici con esse (prodotti finali di lipoossidazione avanzata)

DANNO INDOTTO DALLA LIPOPEROSSIDAZIONE ALLE MEMBRANE BIOLOGICHE

(acidi grassi polinsaturi) perossidazione dei PUFA (acidi grassi polinsaturi) RADICALI LIBERI ridotta fluidita’ di membrana compromessa attività cellulare NEOPLASIE INVECCHIAMENTO MALATTIE CARDIOVASCOLARI

Effetto dei ROS sulle macromolecole    Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati H2O2 e HOCl e ONOO- reagiscono con la metionina e la tirosina per formare nitro-e-clorotirosina e metionina solfossido  

Effetto dei ROS sulle macromolecole Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate. I maggiori prodotti dell’ossidazione sono la 8-ossiguanosina (il principale indicatore di danno al DNA), timinaglicole, 5-idrossimetiluracile  

RADICALI LIBERI E ACIDI NUCLEICI

EFFETTI DEI RADICALI LIBERI NEI SISTEMI BIOLOGICI

Difese antiossidanti   Per evitare i danni ossidativi, la cellula ha sviluppato un sofisticato sistema di difesa nei confronti dei ROS di natura enzimatica e non (attività “scavenger”). Tali meccanismi di difesa sono fondamentali per l’omeostasi redox cellulare che dipende dal bilancio tra generazione dei ROS e sistemi antiossidanti. Quando l’equilibrio si sposta a favore dei primi oppure la cellula si trova in uno stato di carenza di difese antiossidanti si crea la condizione di stress ossidativo. I principali enzimi responsabili dell’omeostasi redox cellulare sono:   la superossido dismutasi (SOD) la catalasi la glutatione perossidasi la tioredossina la perossiredossina Questi enzimi funzionano come “scavengers” dei ROS, ma non possono intervenire direttamente sulle macromolecole biologiche a rimuovere un danno già avvenuto.

Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI Enzimi: SOD, catalasi, glutatione perossidasi Proteine: proteine-SH, leganti metalli (Fe, Cu) Altre molecole: acido urico, bilirubina ... ESOGENI Vitaminici: Vitamina C Vitamina E Carotenoidi (b-carotene) Non vitaminici: Carotenoidi Polifenoli

Meccanismo d’azione degli antiossidanti Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti, farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, … Antiossidanti preventivi Bloccano la formazione dei radicali Specie Chimiche Reattive Bloccano la reazione di inizio Antiossidanti scavenger Attacco di biomolecole (glicidi, lipidi, proteine, ecc) Bloccano la reazione di propagazione Reazioni radicaliche a catena Antiossidanti di riparo e de novo Riparano il danno e ricostituiscono le membrane Danno ossidativo Invecchiamento, malattie

ANTIOSSIDANTI PREVENTIVI Prevengono la formazione dei radicali liberi

ANTIOSSIDANTI SCAVENGER Riducono la concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano Natura idrofila: albumina, acido urico, vitamina C Natura lipofila: carotenoidi, vitamina E, coenzima Q

AGENTI DI RIPARO AGENTI DI ADATTAMENTO Enzimi che intervengono dopo il danno effettuato dai radicali liberi Idrolasi, transferasi, polimerasi AGENTI DI ADATTAMENTO Sostanze o tecniche attraverso le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante fisiologico di un organismo esercizio fisico, regime alimentare corretto ed equilibrato

ANTIOSSIDANTI SOLUBILITA’ RDA M/F DOVE VitaminaA Vitamina C Vitamina E Licopene Bioflavonoidi GTE (green tea extract) Sali di Mg,Zn Se, Cr Grassi poliinsaturi Acidi grassi (Omega 6) Acidi grassi (Omega 3) liposolubile idrosolubile Idrosolubile 1000/800 60/60mg 10/8 mg 1.7/1.3 mg  5 gr 5-6 gr Frutta gialla, arancione o verde scura Frutta, ortaggi a gemma Fegato, uova Pomodoro Cereali, carne, latte Te’ verde Olio d’oliva Semi vegetali Pesce

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) ENZIMATICI, CELLULARI SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) Principale antiossidante cellulare, mantiene bassa la concentrazione di anione superossido (O2-• ) Converte l’anione superossido in perossido d’idrogeno Agisce in collaborazione con la catalasi e la glutatione perossidasi

La superossido dismutasi (SOD)

La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi), La SOD catalizza la reazione di dismutazione dell’anione superossido: 2 O2- + 2H+  H2O2 + O2 Se ne conoscono varie forme isoenzimatiche. Nei mitocondri l’isoenzima utilizza come cofattore il manganese (MnSOD).   Altri isoenzimi, di cui alcuni anche a localizzazione nucleare hanno come cofattori rame o zinco (Cu/ZnSOD). Esiste anche un isoenzima Cu/ZnSOD extracellulare secreto (EC-SOD) La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi), localizzata nei perossisomi, inattiva l’H2O2 catalizzando la reazione: 2H2O2  O2 + 2H2O contiene un gruppo eme

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI CATALASI (CAT) 2 H2O2 2 H2O + O2 Eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli RBC Agisce con la SOD per la rapida detossificazione dell’anione superossido (O2-•)

R-OOH + AH2  R-OH + A + H2O PEROSSIDASI (Px) Diverse forme, diverse localizzazioni, diversi substrati Difesa cellulare primaria contro i perossidi (R-OOH, H2O2) Convertono i perossidi in H2O in presenza di riducenti R-OOH + AH2  R-OH + A + H2O

La glutatione perossidasi

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px) 2 H2O2 2 H2O + O2 ROOH ROH + H2O 2 GSH GSSG GLUTATIONE REDUTTASI NADP+ NADPH2 Richiede selenio (cofattore) e glutatione (riducente)

GLUTATIONE (GSH) Tripeptide (Glu-Cys-Gly) endogeno idrofilo a basso PM Cofattore della glutatione-perossidasi (GPx) Consente alla GPx di svolgere il suo ruolo antiossidante

GLUTATIONE (GSH) Azione disintossicante Attività immunitaria Attività protettiva nei riguardi del SNC E’ presente in alimenti quali: cocomero, avocado, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, spinaci.

Agenti esogeni/metabolismo Ciclo del glutatione 2 NADP+ 2 NADPH + H+ 2 GSH GS – SG 2 H2O H2O2 GS – SG TRASLOCASI ESCREZIONE Pr – SH Pr – SG + GSH H2O + ½ O2 O2• GSH–R GPx SOD CAT Agenti esogeni/metabolismo SOD: superossidodismutasi CAT: catalasi GPx: glutatione perossidasi GSH-R: glutatione reduttasi

la vitamina C (o acido ascorbico), la vitamina E (o a-tocoferolo), Le principali molecole non enzimatiche che contribuiscono all’equilibrio redox cellulare sono: la vitamina C (o acido ascorbico), la vitamina E (o a-tocoferolo), vitamina A (o b-carotene), l’urato, il piruvato, e infine il GSH La vitamina C e la vitamina E agiscono in maniera coordinata e sinergica: la vitamina C rigenera l’a-tocoferolo trasformandosi in radicale ascorbile, e viene riconvertita ad acido ascorbico da una reduttasi NADPH-dipendente. L’a-tocoferolo protegge le membrane dal danno ossidativo in quanto blocca le reazioni a catena caratteristiche del processo di perossidazione lipidica delle membrane biologiche.

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI NON ENZIMATICI PROTEINE -SH: Agiscono come antiossidanti plasmatici. Acquistano un e- generando un radicale sulfidrilico (-S•) più stabile. PROTEINE LEGANTI Cu-Fe: Proteine di trasposto: transferrina (2Fe+++) e ceruloplasmina (Cu++) Proteine di deposito: ferritina (FeOOH)

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI NON ENZIMATICI BILIRUBINA: Prodotto di degradazione dell’eme Blocca i radicali perossilici a livello plasmatico ACIDO URICO: Prodotto finale del catabolismo delle purine (adenina e guanina) Chela i metalli e riduce l’ozono (antiossidante del tratto respiratorio)

ACIDO URICO Sostanza a basso peso molecolare, idrofila Potente scavenger contro vari ossidanti (HO•,O2*, O3, HClO) Chelante nei confronti di metalli di transizione (Fe, Cu) Previene l’ossidazione Fe-dipendente dell’ascorbato

ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI ACIDO ASCORBICO (Vitamina C) Principale antiossidante extracellulare idrosolubile Può bloccare O2-•, HO•, H2O2, 1 O2 Riducendo il radicale tocoferile rigenera la vitamina E Il radicale ascorbile è rigenerato dalla NADPH deidroascorbato reduttasi, mentre il deidroascorbico dall’ascorbico reduttasi-GSH. Vitamina C

ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI VITAMINA E

Attività antiossidante vitamina E

ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI VITAMINA E Sostanza liposolubile. Principale radical-scavenger delle membrane e delle lipoproteine. Agisce bloccando i radicali perossilici formatisi durante la perossidazione lipidica. Può essere rigenerata dall’acido ascorbico e dal GSH.

VITAMINA E Molecola liposolubile associata alle membrane biologiche e alle lipoproteine protegge i grassi poliinsaturi dalla perossidazione ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE A carico di RRR- tocoferil succinato potente agente antitumorale ATTIVITA’ NON ANTIOSSIDANTE

INIBISCE LA PROLIFERAZIONE VITAMINA E e neoplasie INIBISCE LA PROLIFERAZIONE DI CELLULE MALIGNE Vit. E CAUSA APOPTOSI È ANTI-ANGIOGENICA INIBISCE VEGF (fattore di crescita vascolare)

ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI CAROTENOIDI Gruppo di pigmenti rossi, arancio e giallo presenti soprattutto nella frutta e vegetali. Sostanze liposolubili. Alcuni hanno attività vitaminica (b-carotene). Presenti nelle membrane cellulari e veicolati dalle lipoproteine. Interrompono le reazioni a catena dei radicali perossili (R-OO•) Bloccano i radicali tra cui anche l’1O2 (ossigeno singoletto) tramite due meccanismi: trasferimento del e- addizione del radicale alla molecola

LICOPENE Antiossidante naturale della famiglia dei carotenoidi, presente in elevate concentrazioni nel pomodoro maturo e in misura minore nel cocomero, albicocca, uva e papaia Chimicamente costituito da carbonio e idrogeno ed in natura è rinvenibile nella struttura “trans” Tempo di emivita 2-3 giorni, maggior metabolita 5,6-diidrossi-5,6diidrolicopene

LICOPENE Sembra avere un ruolo importante nella prevenzione di alcune malattie degenerative quali il cancro e le malattie vascolari, che sembrano in parte dipendere da fenomeni ossidativi Il meccanismo di azione alla base dell’attività antitumorale del licopene è ancora sconosciuto

LICOPENE In pazienti con tumore della prostata la supplementazione con licopene per sole 3 settimane ha determinato una riduzione dei valori sierici di PSA (un marker usato comunemente per monitorare l’andamento della malattia), suggerendo un effetto antiproliferativo specifico sulle cellule neoplastiche prostatiche

ANTIOSSIDANTI ESOGENI NON VITAMINICI POLIFENOLI Ampia classe di composti derivati dal metabolismo secondario delle piante Chimicamente sono derivati ciclici del benzene sostituiti con gruppi idrossilici Comprendono molecole sia semplici come gli acidi fenolici oppure altamente polimerizzate come i tannini Scavenger nei confronti dei radicali HO• e O2•

Struttura dei flavonoidi Struttura degli acidi fenolici bloccare i radicali liberi legare i metalli di transizione inibire l’ossidazione delle LDL rigenerare il radicale tocoferile

ACIDO LIPOICO Forma ridotta (attiva) Forma ossidata Sostanza a basso peso molecolare, relativamente idrofila Scavenger di vari ossidanti (HO•, O2*, HClO) Chelante nei confronti dei metalli di transizione (Fe, Cu) Consente la rigenerazione delle vitamine C ed E Prodotto nell’organismo, è coinvolto nel complesso della piruvato deidrogenasi, funzionando da accettore di elettroni, grazie al suo ponte disolfuro, reattivo Forma ridotta (attiva) Forma ossidata

Ac. LIPOICO (25-100µM) ATTIVITA’ antiossidanti: Catalasi (+55%) Superossido dismutasi Glutatione reduttasi Glutatione perossidasi Glutatione transferasi induce Effetto dose dipendente ACCUMULO ROS (-55%) Ac. LIPOICO (25-100µM) riduce

Ossidante (H2O2) + Acido Lipoico 0.01-0.1mM DIMOSTRAZIONE IN VITRO DELL’ EFFETTO PROTETTIVO DELL’AC.LIPOICO IN Saccaromycetes cerevisiae Perossido di Idrogeno (H2O2) 4-5mM Ossidante (H2O2) + Acido Lipoico 0.01-0.1mM Riduce le possibilità di sopravvivenza della cellula (Saccaromycetes cerevisiae) Aumenta la possibilità di sopravvivenza della cellula Aumenta il n delle generazioni successive Riduce il n delle generazioni successive

Coenzima Q10 Sostanza lipofila a basso peso molecolare Scavenger nei confronti dei radicali perossilici (ROO•) Consente la rigenerazione dei tocoferoli

Ruolo del Coenzima Q e della vitamina E nell’inibizione della perossidazione lipidica

ZINCO Componente essenziale di numerosi enzimi, in cui svolge un ruolo strutturale, di regolazione e catalitico: l’amminoacil-RNA-sintetasi, la DNA e l’RNA polimerasi, la fosfatasi alcalina, la lattico deidrogenasi, la superossido dismutasi e le carbossipeptidasi A e B Attività antiossidante, prevenendo la perossidazione lipidica e riducendo la formazione dei radicali liberi

MANGANESE E’ un cofattore dell’attività di numerosi enzimi (arginasi, piruvato carbossilasi, superossido dismutasi) SELENIO Componente dell’enzima glutatione perossidasi, che impedisce l’ossidazione dell’emoglobina e quindi l’emolisi degli eritrociti. Agisce in sinergismo con la vitamina E Azione antiforfora e antimicotica

In laboratorio, per valutare lo stato redox, è possibile dosare: Alcuni enzimi antiossidanti (SOD, GPx, glutatione reduttasi, catalasi) Vitamine Potere antiossidante totale del siero Prodotti di lipoperossidazione (malonildialideide MDA, sostanze reattive all’acido tiobarbiturico TBARS) Metaboliti reattivi dell’ossigeno (ROM’s)

R-OOH Valutazione dello stress ossidativo ed idroperossidi Gli idroperossidi sono marker ed amplificatori delle lesioni da STRESS OSSIDATIVO Aumentata produzione di ROS (O2., HO., H2O2,…) Compromissione della barriera antiossidante (vit. C, vit. E,…) Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi R-OOH (una classe di ROM) IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO) NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)

STRESS OSSIDATIVO: valutare per riequilibrare VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO Valutare l’“attacco” Status pro-ossidante Valutare la “difesa” Status antiossidante PREVENZIONE E MONITORAGGIO DELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO d-ROMs test, MDA OXY-Adsorbent test, BAP test, -SHp test… Valutazione dello stress ossidativo

TEST DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELLO STATUS PRO-OSSIDANTE d-ROMs test - Test spettrofotometrico che consente di determinare, in un campione biologico, la concentrazione degli idroperossidi (ROOH) su diversi substrati biochimici - Gli analiti misurati nel test sono metaboliti reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen metabolites, ROM)

1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL Gli idroperossidi presenti in un campione biologico, dopo aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano un derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile e quantificabile per via spettrofotometrica. La concentrazione degli idroperossidi, direttamente proporzionale all’intensità del colore rilevato, viene espressa in unità di U CARR (Carratelli) 1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL

Principio del d-ROMs test Reazione di Fenton: un metallo di transizione in forma ionica (Fe o Cu) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove specie radicaliche (idroperossili (ROO*) o alcossili (RO*), a seconda che lo ione catalizzante si ossidi (Fe2+ Fe3+ o Cu+ Cu2+) o si riduca. Nel test gli idroperossidi, nelle condizioni previste dalla reazione di Fenton, generano in vitro radicali idroperossilici ed alcossilici. 1a) R-OOH + Fe2+ R-O* + Fe3++ OH- 1b) R-O* + A-NH2 R-O- + [A-NH2*]+ 2a) R-OOH + Fe3+ R-OO* + Fe2+ (Cu+) + H+ 2b) R-OO* + A-NH2 R-OO- + [A-NH2*]+

Procedura sperimentale: Un’aliquota di siero viene diluita in una soluzione tampone (acetato) pH 4.8; il ferro ionico legato alle sieroproteine, si rende disponibile in forma libera catalizzando la scissione degli idroperossidi in radicali idroperossilici ed alcossilici. Alla soluzione viene aggiunto un cromogeno (N,N-dietil-parafenilendiammina) che ha la proprietà di cambiare colore (dal rosa al rosso) quando viene ossidato.

E’ necessario preparare lo standard (o calibratore), fornito all'interno di un kit commerciale sottoforma di siero liofilo a titolo noto (U CARR). Procedura cinetica standard: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione (preferibilmente siero fresco) e calibratore) incubazione delle soluzioni per 1 min a 37°C; lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm) a 0, 1, 2 e 3 min. Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.

Procedura endpoint: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione (siero o plasma eparinato) e calibratore). incubazione delle soluzioni a 37°C per 75 min; lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm). Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.

250-300 U CARR cioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2 Valori di riferimento nell’uomo: 250-300 U CARR cioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2 Un aumento delle U CARR indica una gravità crescente di stress ossidativo

Unico test disponibile per la valutazione complessiva della componente lesiva, pro-ossidante, dello stress ossidativo che unisce a questa specificità una standardizzazione utile nella pratica clinica routinaria e la possibilità di integrarsi con altri test sullo stress ossidativo. · preciso e affidabile; · richiede una strumentazione relativamente semplice (un fotometro termostatato ed una centrifuga); · possiede tutti i vantaggi di un mono test (rilevazione fotometrica diretta di un’unica miscela di reazione, contenente il campione e il reattivo cromogeno); · richiede una minima manualità, con notevole riduzione delle possibilità di errore.

nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione; essi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica, MDA)

MDA test MDA (malonilaldeide o malonildialdeide, CHO-CH2-CHO): prodotto finale delle reazioni a catena innescate nelle membrane cellulari dall’attacco ossidativo, da parte di alcuni ROS (radicale idrossile), degli acidi grassi poliinsaturi (acido arachidonico, costituente dei fosfolipidi di membrana). MDA: indicatore piuttosto tardivo di stress ossidativo. Svantaggi: non è sempre in grado di poter svelare precocemente uno stato ossidativo alterato.

La MDA è scarsamente specifica; è un prodotto di decomposizione ossidativa di amminoacidi, di carboidrati e di prostaglandine; E’ un prodotto di ossidazione dell’acido ascorbico, risulta inutilizzabile il suo dosaggio ai fini di un eventuale monitoraggio terapeutico in corso di trattamenti antiossidanti.

TOTAL ANTIOXIDANT STATUS Valutazione dell’efficacia della barriera ossidante, che si oppone all’azione lesiva dei radicali PRINCIPIO DEL METODO Rilevazione della capacità del siero in esame di opporsi ed inibire la cascata di reazioni che portano alla formazione dei radicali liberi

Nel plasma è identificabile una “barriera antiossidante”, alla cui costituzione contribuiscono sostanze esogene ed endogene. Questi componenti, “donando” elettroni, bloccano la potenziale lesività dei radicali liberi. Qualsiasi “insulto” a carico di tale barriera consente ai radicali liberi di attaccare e danneggiare le strutture cellulari. Rappresentazione schematica della barriera antiossidante plasmatica

L’efficienza della barriera antiossidante plasmatica può essere valutata saggiandone la capacità di ridurre un determinato substrato, ossia di donare elettroni ad un agente ossidante (avido di elettroni), che funge da “sensore”. Il potere antiossidante è, in termini rigorosamente chimici, un’attività riducente, cioè elettron-donatrice.

BAP-TEST BAP test (biological antioxidant potential, determinazione del potenziale biologico antiossidante): test fotometrico. Si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe3+) complessati ad un cromogeno di colorarsi, quando gli ioni Fe3+ sono ridotti a ioni ferrosi (Fe2+), come accade se si aggiunge ad essa un adeguato sistema riducente, ossia antiossidante, quale il plasma.

Il campione di plasma (ottenuto dal sangue intero mediante centrifugazione) viene aggiunto ad una soluzione colorata (FeCl3, cloruro ferrico + cromogeno, un tiocianato). Dopo un’incubazione (5 min) la soluzione si decolorerà e la decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i componenti del plasma ridurranno gli ioni ferrici presenti, responsabili della formazione del complesso cromatico. Valutando per via fotometrica l’entità della decolorazione, sarà possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e alla capacità riducente, ossia al potere antiossidante del plasma testato.

I risultati del BAP test sono espressi in mmoli di ferro ridotto per L di plasma esaminato. Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%). Interferenza segnalata è legata alla concentrazione lipidica: un plasma iperlipemico può indurre una sottostima dei valori. Il test va obbligatoriamente eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione massiva di antiossidanti per os.

Il BAP Test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco, con lettura fotometrica a 505 nm a 37°C. Data l’esigua quantità di campione necessaria (10 µl per l’analisi manuale) il prelievo può essere venoso o capillare.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Il range stimato del BAP test negli individui normali è 2200-4000 mmoli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto dell’intervallo indicato è direttamente correlato con una ridotta efficienza della barriera antiossidante plasmatica.  

OXY-Adsorbent test Test fotometrico che valuta la capacità del plasma di opporsi all’azione ossidante di una soluzione di acido ipocloroso, HClO (ossidante). Il campione di plasma viene sottoposto all’azione di HClO a titolo noto, in evidente eccesso rispetto alle capacità di essere “adsorbito” dalla barriera antiossidante da valutare. Dopo un intervallo di tempo stabilito, l’HClO residuo reagisce con la N,N-dietilparafenilendiammina che, ossidandosi a spese dell’acido, si trasforma in un derivato colorato in rosa.

La concentrazione del complesso colorato sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di HClO rimasta in eccesso ed inversamente proporzionale alla capacità antiossidante del plasma analizzato; più bassa è la concentrazione residua dell’acido e più elevata è la capacità antiossidante del campione di plasma esaminato, e viceversa.

Il valore di riferimento del test è al di sopra di 350 mmoli/mL di HClO. In condizioni normali, 1 mL di plasma umano è in grado di “adsorbire” e, quindi, neutralizzare, almeno 350 mmoli di HClO. Valori inferiori a questa soglia indicano una riduzione dello “spessore” della barriera antiossidante e correlano direttamente con la gravità del danno da questa subito.

Il test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco con lettura fotometrica a 505 o 546 nm a TA. Il prelievo può essere venoso o capillare. Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%). Il test va eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione massiva di antiossidanti per os.

SHp test Si basa sulla capacità dei gruppi -SH di sviluppare un complesso colorato determinabile fotometricamente (405 nm) quando reagiscono con l’acido 5,5ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB). Il “titolo” di tioli è direttamente proporzionale all’intensità del colore rilevato. Grado accettabile di imprecisione analitica. Infatti, il CV intra-serie su 20 aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello inter-serie su 20 aliquote di siero congelato 3.3%. I tioli rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera antiossidante plasmatica

Il range negli individui normali è 450-650 mmoli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo intervallo si correla direttamente con una ridotta efficienza della barriera antiossidante tiolica.

Sistema FREE (Diacron) Sistema analitico integrato che consente di eseguire qualsiasi tipo di analisi chimica basata sul principio della fotometria Predisposto per l’esecuzione di test per la valutazione globale dello stress ossidativo (d-ROMs test, l’OXY-adsorbent test, il BAP test e l’-SHp test).

SISTEMA FRAS (Diacron) Sistema analitico integrato costituito da un fotometro con centrifuga incorporata progettato per consentire l’esecuzione del d-ROMs test su sangue intero, ottenuto mediante prelievo di sangue capillare. Viene fornito insieme al kit del d-ROMS test che ne costituisce parte integrante.

Una goccia di sangue, prelevata per digitopuntura, è raccolta in un piccolo capillare e, insieme a questo tubicino, immersa in una provetta contenente una soluzione tampone lievemente acida. Il campione, dopo una delicata agitazione, è trasferito in cuvetta, ove viene aggiunta una goccia di reattivo cromogeno. La soluzione è sottoposta a centrifugazione e alla lettura fotometrica. Il fotometro trasformerà l’intensità del colore (proporzionale alla quantità di radicali e, quindi, di idroperossidi presenti nel campione) in unità di concentrazione (U CARR), a cui possono corrispondere determinati livelli di stress ossidativo.

dROM test: errori da evitare

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