Chimica analitica Obiettivi formativi Prerequisiti Contenuto del corso Il corso intende fornire allo studente le conoscenze fondamentali di teoria, funzionamento e trattamento dei dati delle metodiche analitiche di maggiore applicazione. Prerequisiti Acquisizione dei concetti maturati in LABORATORIO DI CHIMICA I A E IB e nei corsi che riguardano la chimica-fisica di base. Contenuto del corso Principi teorici, metodologie e strumentazione delle tecniche analitiche separative: gas cromatografia, liquido cromatografia (a fase diretta, a fase inversa, a scambio ionico), elettroforesi, frazionamento in campo flusso, e delle tecniche spettroscopiche: infrarosso, ultravioletto-visibile e spettroscopia atomica (di emissione ed assorbimento). Elementi delle metodiche elettroanalitiche. Principi di spettrometria di massa. Metodologie analitiche accoppiate con accenni alle applicazioni più recenti. Teoria degli errori e metodi statistici elementari applicati alle misure analitiche. Principi di chemiometria e di valutazione della qualità del dato analitico. Testi di riferimento Chimica Analitica Strumentale K.A. Rubinson, J.F. Rubinson Zanichelli Ed., Bologna, 2002 Chimica Analitica - teoria e pratica F.W. Fifield, D. Kealey Zanichelli Ed., Bologna, 1999   Chimica Analitica Quantitativa D. C. Harris Zanichelli Ed., Bologna, 1991 Fondamenti di Chimica Analitica Skoog, West, Holler, Crouch II edizione. EdiSES srl, Napoli, 2005 Statistics For Analytical Chemistry J. C. Miller, J. N. Miller John Wiley & Sons, NewYork, 1984 Modulo Spettrometria di massa e tecniche accoppiate – Andrea Zattoni - 8 ore

Che cos’è la spettrometria di massa? Sorgente di fotoni Dispersione Spettroscopia di fotoni hν νn Spettro di frequenza ν1 Spettroscopia di ioni gassosi Campo magnetico + – m/z Campo elettrico (m/z)1 (m/z)2 Spettro di massa MS: tecnica spettroscopica o tecnica separativa?

Quali informazioni dà la MS? Dalla MS si possono ricavare informazioni su: La massa atomica ed i rapporti isotopici degli atomi di un elemento La composizione qualitativa e quantitativa di analiti in miscele complesse La struttura di specie molecolari complesse La struttura e la composizione di superfici solide

MS: un secolo di storia… 1912 Prima MS 1936-37 MS di ioni secondari 1952 Strumenti a doppia focalizzazione 1965 Risonanza ionica di ciclotrone 1984 Interfaccia a fasci di particelle 1968 Ionizzazione elettrospray 1918 Ionizzazione elettronica e focalizzazione magnetica 1946 MS a tempo di volo                                 1966 Ionizzazione chimica 1953-58 Analizzatori a quadrupolo 1974 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica …e cinque Premi Nobel 1906 1922 1989 2002 J.J. Thomson F.W. Aston W. Paul J.B. Fenn K. Tanaka

Sviluppi ed applicazioni della MS Sviluppo Data approx Applicazione Descrizione del comportamento degli ioni in campi magnetici 1920 Determinazione dell’abbondanza isotopica degli elementi Doppia focalizzazione 1935 Raggiungimento di una elevata risoluzione di massa Primo spettrometro di massa commerciale 1950 Analisi qualitativa di prodotti petroliferi Sorgente ad arco 1955 Analisi qualitativa degli elementi Teoria della frammentazione delle specie molecolari 1960 Identificazione e analisi strutturale di molecole complesse Accoppiamento Spettrometria di massa/gascromatografia 1965 Analisi qualitativa e quantitativa di miscele complesse Spettrometri di massa accoppiati 1970 Analisi veloce di miscele complesse Nuove tecniche di ionizzazione Miglioramento della capacità di determinazione strutturale Applicazione della FFT alla MS 1980 Miglioramento della risoluzione di massa e del rapporto segnale/rumore Miglioramento delle sorgenti per specie non volatili Analisi di molecole polimeriche e di superfici Accoppiamento con la cromatografia liquida (LC/MS) 1990 Analisi di specie non volatili in miscele complesse. Applicazioni biologiche (proteomica)

Alcune definizioni (I) Unità di massa atomica (u): è definita come 1/12 dalla massa di un atomo di 12C. Si indica talvolta con il simbolo Da (Dalton). Numero di carica (z): è un numero intero che esprime il rapporto tra la carica dello ione e la carica dell’elettrone (e) Massa molecolare relativa (Mr): il rapporto della massa di una molecola con l’unità di massa atomica u. Rapporto massa/carica (m/z): il rapporto tra la massa di una molecola e la sua carica elettrica. Si esprime di solito come massa molecolare relativa divisa per il numero di carica. È la grandezza misurata in spettrometria di massa. Si indica talvolta con il simbolo Th (Thomson).

Alcune definizioni (II) Massa Nominale: è coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni: è quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento. Massa Esatta: è la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma è determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura è ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C Peso Atomico: (quello usato in stechiometria): è la media ponderale delle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolare elemento.

Moto degli ioni in un campo elettromagnetico Energia traslazionale di uno ione di massa m e carica z Forza magnetica che agisce ortogonalmente a Forza centrifuga All’equilibrio, FM = FC , per cui 1 2 r Fc FM B V + m, z

Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli Lo spettro di massa Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Intensità relativa m/z Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli

Spettro di massa multicarica (ESI/qTOFMS) Lo spettro di massa Spettro di massa multicarica (ESI/qTOFMS) m/z Albumina del siero bovino: Mr = 64 000

Spettro di massa di frammentazione Lo spettro di massa Spettro di massa di frammentazione 43 29 57 72 Spettro semplificato del pentano CH3 CH2 CH2 CH2 CH3

Spettro di massa di abbondanze isotopiche Lo spettro di massa Spettro di massa di abbondanze isotopiche Profili di abbondanza isotopica per 3-7 atomi di Cl

Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

Componenti di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione del campione Consente di trasferire il campione dal suo stato originario (solido, liquido o gassoso) ad una forma adatta alla ionizzazione. Sistema di ionizzazione E’ il dispositivo in cui si formano gli ioni gassosi degli analiti o di loro frammenti Analizzatore di massa E’ un dispositivo che separa gli ioni gassosi in base al loro rapporto m/z, nello spazio (ossia deviandoli su diverse traiettorie) o nel tempo (ossia facendo loro percorrere la stessa traiettoria in tempi diversi).

Componenti di uno spettrometro di massa Rivelatore E’ un dispositivo che consente di misurare la quantità di ioni che emergono dall’analizzatore di massa, convertendone l’energia cinetica in corrente elettrica. Sistema di controllo e di acquisizione del segnale Controlla l’introduzione del campione, le modalità di ionizzazione, i parametri di lavoro dell’analizzatore e registra il segnale acquisito dal rivelatore Sistema da vuoto Deve avere un’efficienza sufficiente a ridurre la pressione del campione in ingresso da 1 atm a quella richiesta nell’analizzatore.

Sistemi di introduzione del campione Sistemi a carica (off line) Il campione viene volatilizzato termicamente ed inviato nella zona di ionizzazione. Sistemi a sonda Per solidi, liquidi non volatili e per campioni in piccole quantità Sistemi per iniezione diretta (o per FIA) Per inviare campioni liquidi ad interfacce a flusso (es. elettrospray) Sistemi cromatografici (GC, LC, CE) Interfaccia online con interfacce a flusso

Accoppiamento cromatografia/MS Caratteristiche di un rivelatore ideale per cromatografia Non alterare la risoluzione cromatografica, ossia non produrre nel rivelatore una miscela dei composti separati. Avere la massima sensibilità possibile. Essere universale, cioè rivelare tutti i composti eluiti. Fornire quante più informazioni possibile sulla struttura dei composti eluiti, per permetterne l’identificazione. Essere selettivo, cioè consentire l’identificazione dell’analita in miscela. Dare un segnale proporzionale alla concentrazione. Avere un fattore di risposta costante, o quantomeno prevedibile. Non danneggiare i prodotti. Non produrre artefatti. Consentire la deconvoluzione dei picchi cromatografici, ossia la scomposizione dei picchi non risolti nei solo componenti. Avere il più basso rapporto costi/prestazioni possibile.

GC/MS a iniezione diretta Colonna GC capillare all’analizzatore di massa Lenti Camera di ionizzazione Colonna GC capillare: d ~ 250 µm L ~ 25 m F ~ 1-2 cm3 min-1

GC/MS open-split con gas di spurgo Un flusso di gas (He) impedisce all’analita eluito di ossidarsi a contatto con l’aria (O2) Vantaggio: facile cambiare la colonna Svantaggio: non arricchisce il campione

Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

Per GC: Impatto elettronico (EI) Ionizzazione chimica (CI) Sorgenti ioniche Per GC: Impatto elettronico (EI) Ionizzazione chimica (CI) Per LC: Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) MALDI (off line)

Classificazione delle sorgenti ioniche Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) Impatto elettronico Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) Ionizzazione chimica Desorbimento (MALDI, elettrospray) Fotoionizzazione

Sorgente ionica ad impatto elettronico Fenditura di prima accelerazione Fenditura di focalizzazione Riscaldatore e catodo Flusso di molecole in ingresso Fenditura di prima accelerazione Riflettore All’analizzatore di massa Anodo Regione di ionizzazione Regione di accelerazione degli ioni (ddp = 103-104 V) Vuoto

Meccanismo di ionizzazione per EI Un fascio di elettroni viene generato da un filamento riscaldato di W o Re ed accelerato da una d.d.p. di ~70V. Il fascio di elettroni urta il fascio di molecole del campione a 90°. I prodotti primari della collisione sono ioni positivi a carica unitaria (ioni molecolari, M+), che si formano per repulsione elettrostatica: M + e-  M•+ + 2e- M•+ è uno ione radicale. Il processo di ionizzazione ha efficienza molto bassa (circa 1/106). M•+ è uno ione instabile (ha un numero dispari di elettroni) e può dare reazioni di decomposizione che danno origine agli ioni frammento. Gli ioni generati vengono attirati con una piccola d.d.p. verso la zona di accelerazione, dove sono soggetti ad un potenziale di 103-104 V per raggiungere le loro velocità finali prima di entrare nell’analizzatore di massa.

Meccanismo di ionizzazione chimica Le molecole del campione vengono ionizzate per collisione con gli ioni di un gas reagente, ionizzato per impatto elettronico. È possibile generare anche ioni negativi per cattura di elettroni “lenti”. Si impiega la strumentazione della EI, opportunamente modificata. Nella zona di ionizzazione il gas reagente viene mantenuto alla pressione di circa 1 torr. Il gas impiegato più comunemente è CH4: CH4 + e-  CH4•+ + 2e- EI del gas di ionizzazione CH4•+ + CH4  CH5+ + CH3• Trasferimento di un protone CH3+ + CH4  C2H5+ + H2 Reazioni ione-molecola CH5+ + XH  XH2+ + CH4 C2H5+ + XH  XH2+ + C2H4 C2H5+ + XH  X+ + C2H6 Lo ione generato può avere massa M+1, M+2, M-1 o anche M+29 (+C2H5).

Sorgenti ioniche a desorbimento Elettrospray – nanospray Bombardamento con atomi veloci (FAB) Desorbimento/ionizzazione per impatto ionico Desorbimento-ionizzazione laser assistiti da matrice (MALDI)

Sorgente elettrospray Gas di trasporto Gocce di circa 1 µm Gas di desolvatazione Liquido di trasporto Campione Cono di Taylor Capillare riscaldato + - 2-6 kV

Meccanismo di deplezione degli ioni Soluzione del campione 4000 V Pressione atmosferica Calore o gas secco Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Livelli successivi di vuoto (2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Spettrometro di massa Esplosione Coulombiana Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della goccia al quale si prevede che le molecole cariche vengano espulse.

Sorgenti ioniche a desorbimento Desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI) L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la formazione degli ioni di analita in fase gas Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che riscalda la matrice e provoca la ionizzazione e il desorbimento di ioni prevalentemente monocarica

Il processo MALDI

Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

Deve garantire una buona trasmissione e focalizzazione degli ioni. Analizzatore di massa Fa sì che al rivelatore arrivino ioni in un ristretto intervallo di massa. Determina in gran parte il potere risolvente dello spettrometro di massa. Deve garantire una buona trasmissione e focalizzazione degli ioni.

Caratteristiche di un analizzatore di massa Intervallo di m/z : indica i valori minimo e massimo di m/z degli ioni che l’analizzatore è in grado di selezionare (determina l’applicabilità per un certo problema analitico). Potere risolutivo: indica la capacità di un analizzatore di distinguere due ioni con rapporti m/z simili tra loro (determina le prestazioni nell’analisi qualitativa). Efficienza di trasmissione: percentuale degli ioni selezionati che raggiungono il rivelatore dopo avere attraversato l’analizzatore, senza venire dispersi (determina le prestazioni nell’analisi quantitativa).

Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati risolti se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale dell’altezza del picco meno intenso (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.

Definizione alternativa Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Picchi risolti al 80% della valle Intensità Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

Analizzatore a settore magnetico Spettrometro di massa a focalizzazione semplice Di solito la sorgente è a EI o CI 60, 90 o 180° 1 2 B Schermo metallico + Lo spettro si registra facendo una scansione di V o di B. La scansione di V permette di usare magneti permanenti per la generazione del campo B. Normalmente gli strumenti commerciali sono a scansione di V. m, z V Ioni più pesanti 10-7 torr Ioni più leggeri Rivelatore R < 2000, perché gli ioni entrano nel settore magnetico con una distribuzione di energie cinetiche, e quindi di velocità.

Analizzatore elettrostatico Energia cinetica 1 2 Forza centripeta + + E m, z V r - Per potere attraversare la fenditura, gli ioni devono avere una determinata velocità. L’analizzatore elettrostatico non è un analizzatore di massa, ma un filtro di velocità, per cui viene utilizzato in combinazione con un analizzatore di massa per aumentarne la risoluzione.

Doppia focalizzazione Spettrometro di Nier-Jonson Piano focale delle energie Punto di doppia focalizzazione (Rivelatore) Piano focale delle velocità – m/z + + – – + Campo elettrico Campo magnetico Risoluzioni (m/Δm) fino a 100 000 al 10% dell’altezza di picco)

Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

Campo “a sella” del quadrupolo Al centro del quadrupolo lo ione si trova in un potenziale elettrico a sella, che ruota alla frequenza del campo a RF. L’energia dello ione viene continuamente convertita da cinetica a potenziale e viceversa. Lo ione assume quindi un moto oscillatorio attorno alla posizione di equilibrio (sull’asse del quadrupolo), con una frequenza ed un ampiezza di oscillazione che dipendono dalla frequenza e ampiezza del campo, dalla massa e dalla carica dello ione.

Traiettorie dello ione piano xz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y piano yz piano xz piano yz Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

Analizzatore di massa a quadrupolo Massimo valore m/z ~ 4 000 Risoluzione ~ 3 000 I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

Trappola ionica a quadrupolo Processore di scansione Generatore di RF Rivelatore Generatore supplementare di RF Elettrodo a calotta (end-cap) Elettrodo ad anello Filamento

Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

MALDI-TOF MS Range di massa fino a 106  Analizzatore a tempo di volo.

Analizzatore a tempo di volo (TOF) Zona di accelerazione con campo elettrostatico E Ioni positivi Sorgente d V = 0 dE = V0 = 20 000 V V = V0 L

Calcolo di m/z dal tempo di volo Energia cinetica Velocità Tempo di volo Al tempo di volo nella zona di volo va aggiunto il tempo di accelerazione nella zona in cui viene applicato di potenziale E = V0/d

Reflectron TOF a stadio singolo Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt Sorgente Reflectron TOF a stadio singolo

Analizzatore di massa a tempo di volo Massimo valore m/z > 200 000 Risoluzione fino a 10 000 – 20 000. Il reflectron consente di: Ridurre le dimensioni Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate Efficiente trasmissione degli ioni

Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

Rivelatori a scintillazione Moltiplicatori di elettroni Rivelatori di ioni Lastre fotografiche Ad AgBr. Sono state i primi rivelatori di ioni Coppa di Faraday Un semplice elettrodo collettore schermato Economico, poco sensibile Rivelatori a scintillazione A cristalli di materiale fosforescente Moltiplicatori di elettroni A dinodi separati A dinodo continuo

Moltiplicatori di elettroni Moltiplicatore a dinodi separati Fascio di ioni All’amplificatore Fenditura Elettroni – Cascata di elettroni + + – – + Superficie conduttrice a resistenza variabile 2kV Collegamento a terra attraverso l’amplificatore Moltiplicatore a dinodo continuo

Doppia spettrometria di massa (MS/MS) Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1

Applicazioni della MS/MS Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

Tandem MS - nomenclatura Corrente ionica totale (total ion current, TIC) 1. (dopo l’analisi di massa): La somma di tutte le correnti ioniche trasportate dagli ioni che contribuiscono allo spettro di massa (detta anche corrente ionica ricostruita). È la somma di tutte le correnti di monitoraggio di ioni singoli (single ion monitoring, SIM) 2. (prima dell’analisi di massa): La somma di tutte le correnti ioniche relative a ioni dello stesso segno, prima dell’analizzatore di massa (il rivelatore è posto tra la sorgente e l’analizzatore di massa).

Tandem MS - nomenclatura Ione molecolare: ione formato per addizione o rimozione di uno o più elettroni dalla molecola dell’analita. Per definizione è lo ione che contiene l’isotopo più abbondante di tutti gli elementi coinvolti (per ragioni statistiche, non sempre dà il picco più intenso). Ione addotto: ione formato dall’interazione di due specie, contenente tutti gli atomi di una di esse e uno o più atomi dell’altra. Ione pseudomolecolare: ione formato dalla molecola dell’analita per sottrazione di un protone (M – H)- o di uno ione idruro (M + H)+, o per formazione di un addotto con uno uno ione presente nel plasma di ionizzazione. Da questi ioni è possibile ricavare la massa molare dell’analita.

Tandem MS - nomenclatura Ione precursore: (ione genitore) uno ione che subisce una decomposizione o una variazione di carica. Ione prodotto: (ione figlio) ione formato da una qualsiasi reazione dello ione precursore. Ione frammento: ione formato dalla frammentazione dello ione precursore. Perdita neutra: specie neutra formata dalla frammentazione di uno ione precursore. Spettro della sorgente: spettro ottenuto con un singolo analizzatore.

MS/MS nello spazio e nel tempo Cella di collisione MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3 Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione

Modalità di scansione MS/MS Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione Scansione dello ione precursore Simbolismo alternativo Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Monitoraggio di reazione selezionata Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b

Informazioni analitiche ricavabili dalla MS Informazioni qualitative Struttura di un composto Composizione di una miscela Purezza di un picco cromatografico Informazioni quantitative Concentrazione dei componenti di una miscela

Analisi qualitativa in MS Interpretazione di uno spettro di massa Obiettivi: Identificazione del composto (o dei composti) da cui ha avuto origine lo spettro di massa. Identificazione di tutti gli ioni frammento che hanno dato origine allo spettro di massa, e formulazione di un’ipotesi sui meccanismi che hanno determinato la frammentazione.

Analisi qualitativa in MS Interpretazione di uno spettro di massa Considerazioni preliminari: Qual è l’origine del campione da cui è stato ricavato lo spettro? Si può escludere la presenza di alcune classi di composti? Lo spettro ottenuto si trova in una banca dati di spettri esistente? (Possibili fonti: banche dati on-line, collezioni di spettri a corredo del software dello strumento).

Interpretazione di uno spettro di massa Informazioni ottenibili da spettri ad alta risoluzione Uno spettrometro ad alta risoluzione è in grado di misurare la massa di uno ione con sufficiente accuratezza (massa accurata) da permettere di determinarne la composizione elementare. I requisiti di accuratezza per la determinazione della composizione elementare crescono rapidamente all’aumentare della massa nominale, perché aumenta il numero di combinazioni possibili.

Interpretazione di uno spettro di massa Composizione elementare dalla massa accurata Masse esatte e formule corrispondenti per vari possibili ioni di massa nominale 180 contenenti solo atomi di C, O, N ed H.

Interpretazione di uno spettro di massa Analisi dell’abbondanza isotopica La maggior parte degli elementi è presente in natura come miscela di isotopi. A causa della presenza degli isotopi, nello spettro di massa si possono individuare gruppi di picchi relativi alla diverse composizioni isotopiche dello stesso ione. L’intensità relativa di tali picchi dipende dalla composizione isotopica, e quindi permette di determinare la composizione elementare di uno ione anche senza conoscerne la massa accurata.

Interpretazione di uno spettro di massa Abbondanza isotopica naturale di alcuni elementi 12C 98.90% 13C 1.10% 1H 99.985% 2H 0.015% 16O 99.76% 17O 0.04% 18O 0.20% 14N 99.63% 15N 0.37% 32S 95.02% 33S 0.75% 34S 4.21% 36S 0.02% 35Cl 75.77% 37Cl 24.23% 79Br 50.69% 81Br 49.31% 19F 100.00% Gli elementi con isotopi con massa A + 2 abbondante (O, S, Cl, Br) sono particolarmente utili.

Interpretazione di uno spettro di massa Esempio: determinazione della composizione elementare dall’abbondanza isotopica Consideriamo i due frammenti C10H20 e C8H12O2 m/z = 140 i due frammenti hanno massa nominale uguale C10H20: (10 × 12 + 20 × 1) C8H12O2: (8 × 12 + 12 × 1 + 2 × 16) Intensità relativa del picco a m/z = 141 dovuto all’abbondanza isotopica (si trascurano gli isotopi di O e H): C10H20: (10 × 1.1%) = 11% C8H12O2: (8 × 1.1%) = 8.8% Dall’intensità relativa dei picchi a m/z = 140 e 141 è possibile distinguere i due frammenti anche da uno spettro a risoluzione unitaria.

Interpretazione di uno spettro di massa Spettro di massa di abbondanze isotopiche Profili di abbondanza isotopica per 3-7 atomi di Cl. L’intensità relativa dei picchi consente di calcolare il numero di atomi di Cl.

Interpretazione di uno spettro di massa Frammenti neutri e frammenti leggeri Lo ione molecolare frammenta producendo frammenti ionici e neutri che non vengono osservati nello spettro. La loro massa si può dedurre dalla differenza di massa tra i picchi osservati nello spettro. Dalla massa di questi frammenti si possono dedurre molte informazioni utili sulla composizione elementare. Ad esempio, se i frammenti contengono solo C e H, la massa dei frammenti è compresa negli intervalli 24-29 (per 2 atomi di C), 36-43 (3 C), 48-57 (4 C), >60 (5 C). Se si osserva una massa fuori da questi intervalli, il frammento contiene necessariamente un atomo diverso da C e H. Alcune masse hanno una sola formula possibile, ad esempio la massa 20 corrisponde solo ad HF.

Interpretazione di uno spettro di massa Numero di anelli ed insaturazioni (I) Quando si conosce la formula elementare di una molecola o di un frammento, si può calcolare il numero di anelli e di insaturazioni presenti nella struttura. Un idrocarburo alifatico ha formula CnH2n+2. Ogni anello o insaturazione diminuisce di due il numero di H. Sia x il numero di H presenti. Se N è il numero di anelli e insaturazioni, si ha: da cui

Interpretazione di uno spettro di massa Numero di anelli ed insaturazioni (II) La presenza di O o di S non modifica il calcolo degli anelli e delle insaturazioni. Ogni atomo alogeno “sostituisce” un atomo di idrogeno, e va quindi sommato al numero di H nel calcolo. Un atomo di N o P fa aumentare di una unità il numero di atomi di H nel composto (es. CH4 e CH3NH2 o CH3PH2). Sia nX il numero di atomi di alogeni, e nN il numero di atomi di N o P. La formula precedente diventa:

Interpretazione di uno spettro di massa Parità elettronica Normalmente le molecole hanno un numero pari di elettroni. I radicali stabili sono rari eccezioni, come NO. In chimica classica, le specie attive sono solitamente ioni con un numero pari di elettroni, oppure radicali, cioè specie neutre con un numero dispari di elettroni. In spettrometria di massa, oltre a ioni con un numero pari di elettroni, si osservano ioni radicali, una classe di composti non comuni nella chimica in soluzione.

Interpretazione di uno spettro di massa Parità di massa Le masse atomiche impiegate nei calcoli stechiometrici sono valori medi risultanti da miscele di isotopi. In spettrometria di massa, il calcolo si basa sulla massa dell’isotopo predominante di ciascuna specie. Siccome gli ioni isotopici vengono separati nello spettrometro di massa, ogni ione produce sempre un gruppo di picchi le cui intensità relative sono determinate dalle abbondanze isotopiche. La maggioranza delle molecole organiche contengono solo atomi di C, H, O, N, S, P ed alogeni. Se calcoliamo la massa delle molecole organiche considerando la massa dell’isotopo prenominante, possiamo calcolare il numero di atomi di azoto.

Interpretazione di uno spettro di massa Regola dell’azoto La massa molecolare di uno ione (calcolata in base agli isotopi predominanti) è sempre pari se il numero di atomi di azoto è pari o nullo. Questa proprietà deriva dal fatto che l’azoto ha massa pari (14) ma un numero dispari di elettroni periferici (5). Tutti gli altri elementi hanno invece la stessa parità per la massa e gli elettroni di valenza

Interpretazione di uno spettro di massa Relazione fra massa e parità elettronica Dal meccanismo di formazione degli ioni e dei radicali si può ricavare la regola dell’azoto si può estendere nel modo seguente: Quando gli atomi di azoto sono assenti o in numero pari, qualunque ione di massa pari ha un numero dispari di elettroni ed è uno ione radicale. Qualunque ione con massa dispari, al contrario, ha un numero pari di elettroni ed è un anione o un catione. L’opposto vale per un numero dispari di atomi di azoto. La regola vale senza eccezioni per molecole contenenti C, H, N, O, S, P, metalli alcalini e alogeni.

Interpretazione di uno spettro di massa Procedura standard di interpretazione (I) Studiare tutte le informazioni disponibili sul campione (origine, dati chimici, dati spettroscopici); verificare le condizioni in cui è stato registrato lo spettro (tipo di sorgente ionica, analizzatore, parametri operativi) e l’accuratezza della calibrazione dei valori di m/z. Dalla massa accurata o dall’abbondanza isotopica determinare la composizione elementare di ciascun gruppo di picchi nello spettro. Calcolare il numero di anelli + doppi legami. Applicare la regola dell’azoto.

Interpretazione di uno spettro di massa Procedura standard di interpretazione (II) Identificare lo ione molecolare. Deve essere il picco a massa più elevata nello spettro con un numero dispari di elettroni. Verificare l’assegnazione dello ione molecolare con una tecnica di ionizzazione soft (ad es. la ionizzazione chimica). Identificare i picchi “importanti”, cioè quelli ad elettroni dispari, di maggiore intensità, di maggiore massa e i picchi più intensi in un gruppo. Valutare l’aspetto generale dello spettro, la stabilità della molecola, i legami labili.

Interpretazione di uno spettro di massa Procedura standard di interpretazione (III) Ipotizzare una serie di possibili assegnazioni strutturali per: Le serie più importanti di ioni a bassa massa. I frammenti neutri più importanti che derivano dallo ione molecolare M•+, indicati dalla massa degli ioni più pesanti e dalla frammentazione secondaria in doppia spettrometria di massa. Gli ioni caratteristici a massa elevata Ipotizzare le possibili strutture molecolari dell’analita, da verificare per confronto con spettri di riferimento, spettri di composti simili e spettri simulati in base ai meccanismi di decomposizione ionica

Analisi quantitativa in MS Scopo dell’analisi quantitativa in MS Lo scopo dell’analisi quantitativa in spettrometria di massa è quello di correlare l’intensità di uno o più segnali nello spettro di massa con la quantità di un composto presente nel campione. I parametri che determinano le prestazioni di un metodo quantitativo sono la specificità (ovvero la capacità di rispondere solo all’analita e non ad interferenti) e la sensibilità (cioè la variazione del segnale al variare della concentrazione) ed il limite di rivelabilità. Si possono applicare in spettrometria di massa diversi metodi quantitativi, che si basano su diversi approcci calibrativi (standard interno, standard esterno, diluizione isotopica).

Analisi quantitativa in MS Selettività Il grado di selettività dell’analisi quantitativa in spettrometria di massa dipende da come si impiega lo spettrometro di massa e in misura maggiore da quale segnale si sceglie di correlare alla concentrazione. Se si è sicuri che lo spettro di massa sia relativo ad un solo composto (puro o separato mediante cromatografia), si può utilizzare come segnale analitico la corrente ionica totale. Se invece si analizza una miscela, si devono scegliere uno o più segnali caratteristici (SIM). Il picco dovrà essere intenso e di massa più elevata possibile (la probabilità di interferenza si dimezza ogni circa 100 Th). Anche l’intensità relativa dei picchi considerati aiuta ad evidenziare possibili interferenze.

Analisi quantitativa in MS Metodi per aumentare la selettività Metodi che agiscono sul campione: consistono nel purificare il campione prima dell’analisi MS. Comprendono l’estrazione con solvente, l’estrazione in fase solida e la cromatografia. Un altro approccio può essere quello di derivatizzare l’analita perché produca ioni di massa più elevata che non diano interferenze. Metodi che agiscono sullo spettrometro di massa: comprendono l’aumento dell’accuratezza dell’analisi di massa e della risoluzione, oltre all’impiego di opportune modalità di scansione in doppia MS, come la SRM. Questi approcci sono impiegati simultaneamente fino ad eliminare con ragionevole certezza tutte le interferenze.

Analisi quantitativa in MS Effetto matrice Anche quando si è certi che il metodo messo a punto sia sufficientemente selettivo, cioè che il segnale misurato sia dovuto solo all’analita, non si può escludere che la contemporanea presenza di specie diverse dall’analita modifichi l’intensità del segnale, inficiando l’analisi quantitativa. Questo fenomeno, detto “effetto matrice”, può essere dovuto ad interazioni chimiche dell’analita con altre specie presenti nel campione, sia prima dell’introduzione nello spettrometro di massa, che durante la fase di ionizzazione (effetto della matrice sull’abbondanza dello ione dell’analita e/o dei suoi frammenti).

Analisi quantitativa in MS Sensibilità e limite di rivelabilità In spettrometria di massa la sensibilità è definita come il rapporto tra la variazione di corrente ionica e la variazione della quantità di campione nella sorgente. Viene espressa in C µg-1. Il limite di rivelabilità è la minima quantità di uno ione che dia un segnale rivelabile. Si riferisce al singolo picco e non all’intero spettro. Se il picco base (picco più intenso) dello spettro è vicino al limite di rivelabilità, lo spettro non sarà normalmente interpretabile. Il limite di rivelabilità dipende dal numero di ioni rivelati, cioè dall’abbondanza degli ioni prodotti dalla sorgente e dal tempo durante il quale il segnale ionico viene integrato.

Analisi quantitativa in MS Modalità di scansione e sensibilità Un metodo di acquisizione del segnale ionico è tanto più sensibile quanto maggiore sarà il tempo che lo spettrometro trascorre acquisendo il segnale al valore di m/z utile per l’analisi quantitativa. Le modalità di scansione totale, monitoraggio di ioni selezionati (SIM) e monitoraggio di reazioni selezionate (SRM, in MS/MS) sono in ordine crescente di sensibilità, perché permettono di dedicare una frazione crescente di tempo dello spettrometro alla rivelazione del segnale utile. Il vantaggio delle SRM rispetto alla SIM dipende da un maggior rapporto segnale/rumore, tipico della doppia spettrometria di massa.

Analisi quantitativa in MS Metodo dello standard esterno Il ruolo dello standard è quello di determinare una relazione matematica tra intensità del segnale misurato e concentrazione dell’analita. Consiste nel preparare un campione sintetico contenente una quantità nota di analita (Mste) e misurarne il segnale (Iste). Per assicurarsi che la relazione fra segnale e concentrazione sia lineare, occorre preparare standard a diverse concentrazioni e costruire una curva di calibrazione. La curva di calibrazione è normalmente lineare in un ampio intervallo di concentrazione nel caso della ionizzazione per impatto elettronico, mentre le altre tecniche di ionizzazione possono essere influenzate dalla quantità di analita nel campione.

Analisi quantitativa in MS Metodo dello standard interno È il metodo che meglio minimizza gli errori. Lo standard interno deve essere puro, assente dal campione originale ed inerte nei confronti di tutti i composti presenti nel campione. Lo standard interno per la MS può essere un analogo dell’analita stesso, marcato con isotopi stabili, oppure un omologo strutturale o un composto della stessa famiglia. È necessario assicurarsi che lo standard interno produca picchi che non interferiscano con quelli degli analiti, o che sia separabile dagli analiti mediante cromatografia.

Analisi quantitativa in MS Spettrometria di massa per diluizione isotopica Si può considerare un caso particolare del metodo dello standard interno. Lo standard è un isotopomero dell’analita. È necessario uno standard per ogni analita. Si basa sulla determinazione del rapporto di intensità tra un picco caratteristico dell’analita (in quantità incognita) e il picco analogo dello standard marcato (in quantità esattamente nota), che avrà una massa diversa a causa della marcatura. L’isotopomero è lo standard ideale, in quanto tutte le sue caratteristiche chimiche sono uguale a quelle dell’analita.