Microscopi e tecniche microscopiche Possiamo dividere i microscopi a seconda del tipo di onda utilizzata per visualizzare le immagini Microscopi Ottici Microscopi Elettronici Permettono di osservare strutture troppo piccole per essere osservate ad occhio nudo

L’ISTOLOGIA ED I SUOI METODI DI STUDIO Per un appropriata comprensione di qualsiasi ramo delle scienze è indispensabile una certa familiarità con gli strumenti e i metodi ad esso propri. La comprensione della morfologia e cioè dell’organizzazione strutturale delle cellule e dei tessuti è un requisito essenziale per comprendere come essi funzionano. Le piccole dimensioni delle cellule e dei componenti della matrice rendono l’istologia dipendente dall’impiego e dal progredire dei microscopi.

visualizzazione di cellule e tessuti Il microscopio è uno strumento fondamentale Storicamente gli studi su cellule, tessuti e organi si sono basati sull’impiego di diversi tipi di microscopi e sulle relative procedure Esistono diversi metodi di microscopia, e la microscopia ottica è stata ed è tuttora la piu’ ultilizzata anche a scopo didattico

DIMENSIONI BIOLOGICHE E DIVERSITA’ DELLE CELLULE

UNITA’ DI MISURA μm 20 μm 1X5 μm 25 nm 7 nm 2nm

microscopia ottica Negli ultimi anni la microscopia ottica è diventata ancora più importante, soprattutto a causa dello sviluppo di metodi per la marcatura specifica per la visualizzazione di singoli costituenti cellulari e la ricostruzione della loro architettura Tridimensionale. Un vantaggio importante della microscopia ottica è che la luce è relativamente poco distruttiva Marcando componenti cellulari specifici con marcatori fluorescenti, possiamo cosi’ osservare i loro movimenti e le loro interazioni in cellule e organismi viventi

microscopia in campo chiaro Il tipi piu’ diffuso di microscopio è quello illuminato a campo chiaro (BFM-bright-field Microscope) perché è poco costoso, facilmente trasportabile ed è in grado di fornire molte informazioni sulla struttura di cellule,tessuti ed organi. Con il BFM si possono studiare cellule viventi, (in vivo) e piccole parti di tessuti o di organi. Limiti: dimensioni del preparato, la risoluzione, l’ingrandimento ed il contrasto.

Immagini al M.O.

Microscopia ottica Una funzione cellulare è correlata alla sua morfologia 2 micron-1 metro in lunghezza rotonde,discoidali,con estensioni filiformi, cubiche, piramidali

Immagini al Microscopio a fluorescenza

L’ingrandimento è il rapporto tra la dimensione dell’immagine e quella dell’oggetto osservato. Il limite superiore effettivo dell’ingrandimento è da 1000 a 1200 diametri (diametro dell’oggetto) Con l’aumentare dell’ingrandimento, il diametro di campo Si restringe e diminuisce la possibilità di dedurre la forma Generale degli oggetti di maggiori dimensioni La risoluzione del microscopio in campo chiaro è di circa 0,25 m

La microscopia ottica è limitata nella finezza dei dettagli che può rivelare, i microscopi che utilizzano altri tipi di radiazioni, -in particolare il microscopi elettronici- possono risolvere strutture molto piu’ piccole di quelle che è possibile risolvere con la luce visibile Gli svantaggi della microscopia elettronica sono che la preparazione dei campioni è molto piu’ complessa ed è piu’ difficile essere sicuri che cio’ che vediamo nell’immagine corrisponda precisamente alla struttura reale che viene esaminata. L’analisi computerizzata dell’immagine utile per ricostruire oggetti tridimensionali a partire da visioni oblique multiple. Tutti questi approcci stanno estendendo la risoluzione e il campo d’indagine della microscopia al punto che possiamo iniziare ad immaginare le strutture di singole macromolecole.

Preparazione Dei Campioni per l'Analisi Istologica Come si preparano sezioni istologiche per la microscopia ottica ed elettronica.

Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3) Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem. Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi).

Fissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide); cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine; si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli"; deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi presenti degradino il tessuto.

Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Disidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O. Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

Inclusione del campione in in mezzo appropriato paraffina o resina Tessuti sono "molli" e fragili Diversi passaggi in paraffina calda La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione