Misure con biomarcatori IV. Biomarkers di genotossicità Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione gennaio 2006

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV2 Stress ossidativo

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV3 Ossigeno tripletto · O – O · 3 O 2 2p 4 2s 2 1s 2

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV4 Fornendo energia 3 O 2 1 O 2 hν

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV5 Ossigeno singoletto O – O : 1 O 2 2p 4 2s 2 1s 2

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV6 Anione superossido ·O - O· ·O – O: - O 2 2- perossido 2O 2 ·- + 2H + H 2 O O 2 dismutazione O 2 ·- + Fe 3+ Fe O 2 ossidazione H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + ·OH + - OH (Fenton) H 2 O 2 + O 2 ·- 3 O 2 + ·OH + - OH (Haber-Weiss) O 2 ·- + ·OH 1 O OH O 2 ·- + NO· OONO - perossinitrito e-e- riduzione Fe/Cu

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV7 Specie radicaliche dellOssigeno (ROS) Prodotte anche dalla catena respiratoria

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV8 Specie radicaliche dellAzoto (RNS) Prodotte prevalentemente dallo smog fotochimico Allinterno dellorganismo vengono prodotte da reazioni dellossigeno molecolare O 2 + L-arginina NO + L-citrullina monossido dazoto O 2 ˉ + NO ONOOˉ perossinitrito ONOOˉ + CO 2 ONOOCO 2 ˉ nitroperossicarbonato ONOOCO 2 ˉ + NO 2 + CO 3 ˉ biossido dazoto e radicale carbonato

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV9 Fonti di Radicali Sorgenti endogene: catena respiratoria, fotosintesi, prostaglandine, perossisomi, autossidazione, fagociti, ossiemoglobina, enzimi ossidativi Sorgenti esogene: xenobiotici, radiazioni (ionizzanti e UV), calore, infezione, iperossia, inquinamento

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV10 Invecchiamento Diminuzione delle difese antiossidanti UV Aumento dello stress ossidativo AUMENTATA PRODUZIONE DI ROS Accumulazione di mutazioni del DNA Stimolazione delle vie di trasduzione del segnale Modificazione di proteine Alterazione della struttura genica Alterazione dellattività genica Alterazione della struttura e della funzione delle proteine Perdita della regolazione dellomeostasi intracellulare ed extracellulare

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV11 Biomarkers di genotossicità e loro significato

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV12 Inquinante o xenobiotico ASSORBIMENTO Distribuzione (sangue, tessuti) Biotrasformazione Metaboliti attivi Metaboliti inattivi Distribuzione (sangue, tessuti) ESCREZIONE Legame a siti criticiLegame a siti non critici Prodotti di degradazione Effetti non tossici Danni reversibili Lesioni precliniche Lesioni cliniche MONITORAGGIO AMBIENTALE MONITORAGGIO dellesposizione biologica MONITORAGGIO delleffetto biologico Meccanismi di riparo DIAGNOSI

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV13 INDUZIONE della SINTESI PROTEICA HSP Effetto sinergico di inquinanti Danno perossidativo alle membrane lisomiali Danno perossidativo alle membrane lisosomiali IDROLASI lipofuscine DNA LISOSOMI Alterazioni del DNA RiparateNon riparate Mutazioni Tumori e carcinogenesi Aberrazioni ai cromosomi Apo-tioneine metallotioneine CytP450 Stimolazione sintesi mRNA Stimolazione sintesi mRNA ESCREZIONE Biotrasformazione Metaboliti METALLI PESANTI XENOBIOTICI ORGANICI METALLI PESANTI ORGANOMETALLI (Sn)

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV14 Danni al DNA

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV15 Tipi di danni al DNA Danni naturali Mutazioni spontanee Danni fisici Da radiazioni ionizzanti e UV Danni chimici Da ROS e inquinanti organici

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV16 Danni Naturali Perdita di basi: il legame glicosidico è labile sotto condizione fisiologiche (formazione di un sito AP). Deamminazione: i gruppi amminici primari sono a volte instabili e possono venire convertiti in chetoni.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV17 Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti Danni diretti: Single Strand Break, Double Strand Break, mismatched bases. Danni indiretti: produzione di ROS.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV18 Danni Fisici: Radiazioni UV Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e foto-invecchiamento (UV-B) Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP (UV-C).

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV19 Danni chimici: ROS Causano ossidazione delle basi e amplificano deamminazioni e depurinazioni. oUn esempio di composto ossidato è OH8dG: causa trasversioni delle basi GC TA

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV20 Danni chimici: inquinanti Organici Genotossici: danno diretto al DNA tramite formazione di addotti (alchilanti in posizioni nucleofile). Epigenetici: danno indiretto al DNA attraverso stress ossidativo o lattivazione di composti pericolosi. Es. IPA.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV21 Formazione di micronuclei Durante la divisione cellulare i cromosomi sono trascinati verso i due poli da fibrille. Se il DNA è rotto il cromosoma non ha centromero in grado di attaccarsi alle fibre. Il DNA danneggiato rimane quindi al di fuori del nucleo principale e forma uno o più micronuclei. I micronuclei si formano sia per rottura del singolo strand (chimica) che per rottura del doppio strand (radiazioni).

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV22 Formazione di micronuclei

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV23 Test dei micronuclei Blocco del ciclo cellulare. Calcolo della % dei micronuclei indotti (separazione incorretta di frammenti cromosomici durante lanafase). Vengono considerati positivi i campioni con correlazione dose-risposta che mostrano una % almeno doppia del bianco. Spesso utilizzato come bioindicatore di genotossicità in ambiente marino con applicazione in mitili.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV24 Addotti al DNA Sono prodotti dallazione dei ROS e/o degli IPA sul DNA

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV25 OH8dG Biomarker clinico del danno ossidativo al DNA. Non è assimilata dalla dieta, tutta lOH8dG urinaria è conseguenza diretta delle lesioni cellulari. Facilmente distinguibile da G con tecniche analitiche. Problema: OH8dG ha un potenziale di ossidazione più basso di G, quindi diventa il sito preferenziale di ossidazione, e forma la guanidinoidantoina.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV26 Referenze sul WEB … Vie metaboliche –KEGG: Degradazione degli xenobiotici: Struttura delle proteine: –Protein data bank (Brookhaven): –Hexpasy Expert Protein Analysis System: Prosite (protein families and domains): Enzyme (Enzyme nomenclature database): –Scop (famiglie strutturali): Enzimi: –Nomenclatura - IUBMB: –Proprietà - Brenda: –Expasy (Enzyme nomenclature database): Database di biocatalisi e biodegradazione: Citocromo P450: Metallotioneine: Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori IV27 …e naturalmente Questo ed altro materiale può essere trovato visitando il sito: Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto lautore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Corso di Laurea in Scienze Ambientali