Spettrometria di Massa E' la tecnica analitica che si basa sulla produzione di ioni da atomi o molecole (sorgente) i quali sono poi separati in accordo con il loro rapporto massa/carica (m/z) (analizzatore) e infine misurati (rilevatore)
La spettrometria di massa e’ una tecnica analitica di delucidazione strutturale basata sulla ionizzazione di una molecola e sulla sua successiva frammentazione in ioni di diverso rapporto massa/carica (M/z) A differenza di altre tecniche spettroscopiche, però, questo è un metodo distruttivo (la molecola non rimane intatta dopo l’analisi), e soprattutto non si basa sull’interazione tra radiazioni e materia. Il principio: Una molecola è ionizzata per espulsione di un elettrone. Il catione che si forma (ione molecolare) in parte si frammenta dando molecole e/o radicali neutri (che lo strumento non rileva), in parte genera cationi e/o radicali cationi (ioni frammento). Lo ione molecolare e i vari ioni che si originano per frammentazione (cationi e radicali cationi) vengono discriminati sulla base del loro rapporto massa/carica e rivelati da un detector. e -
Le fasi L’esperimento di spettrometria di massa consiste dunque nella: ionizzazione di molecole in fase gassosa separazione dei diversi ioni prodotti rivelazione degli ioni prodotti
Il risultato dell’esperimento è lo spettro di massa, che rappresenta l’abbondanza relativa degli ioni in funzione del loro rapporto massa/carica (ricordiamo che per ottenere uno spettro di massa, dunque, il requisito essenziale è di produrre degli ioni in fase gassosa).
Vantaggi Questa tecnica consente di misurare le masse molecolari (sia nominali che esatte) e di ottenere dei profili di frammentazione che sono specifici per ciascun composto, di cui costituiscono quindi un’impronta digitale. Si può così individuare la formula di struttura di composti sconosciuti, anche avendone a disposizione piccole quantità.
Lo strumento L’interpretazione dello spettro di massa consiste nello studio dei segnali dovuti agli ioni generati nell'esperimento, dai quali si può ricostruire a ritroso la struttura molecolare originale. Da notare che il vuoto (che si aggira intorno ai 10-6 – 10-5 torr) è necessario per impedire una perdita di ionizzazione per urto con i gas atmosferici.
Introduzione del campione L’introduzione del campione nella camera di ionizzazione può essere fatta sia allo stato solido, usando una sonda, che allo stato liquido o gassoso, usando un sistema di valvole che permettono di accedere alla camera di ionizzazione senza che questa venga a contatto con l’esterno. La quantità di prodotto necessario per registrare uno spettro è dell’ordine dei microgrammi/nanogrammi. E' possibile utilizzare l'uscita di un sistema GC o HPLC come ingresso dello spettrometro di massa. Queste tecniche, note come GC-MS e HPLC-MS, sono estremamente utili nell'analisi di miscele di prodotti.
Camera di ionizzazione Se una molecola è investita in fase vapore da un fascio di elettroni di notevole energia cinetica si può avere per urto la sua ionizzazione a ione positivo o negativo. In genere gli strumenti sono regolati per lavorare unicamente con ioni positivi, i quali possono spontaneamente o per urto decomporsi in una serie di frammenti di massa inferiore e questi a loro volta in altri. Ogni molecola avrà quindi una sua frammentazione caratteristica e specifica che dipenderà sia dalla natura delle molecole sia dalle condizioni operative di ionizzazione. Il campione viene ionizzato in un’apposita camera di ionizzazione, in cui il fascio di elettroni viene prodotto da una sorgente ionica che varia a seconda della tecnica utilizzata. In genere gli elettroni sono emessi da un filamento caldo di tungsteno o renio, e passano attraverso un condotto, che crea il raggio, nella parte centrale della camera che contiene il campione gassoso. La frazione di elettroni che non urta contro le molecole è raccolta da una trappola per gli elettroni, le molecole che non sono ionizzate sono allontanate dalla pompa ad alto vuoto, mentre quelle ionizzate sono accelerate e convogliate verso l’analizzatore.
Sorgenti di ioni In base al tipo di sorgente utilizzata la ionizzazione primaria del campione viene realizzata in vario modo. Le tecniche più utilizzate sono: 1) impatto elettronico (E.I.) 2) ionizzazione chimica (C.I.) 3) electrospray (E.S.I.)
Analizzatori
Glossario - spettrometria di massa.
Sorgenti di ioni CI (Chemical Ionisation) ionizzazione chimica. Ionizzazione dovuta alla reazione con sostanze gassose. DI (Desorption Ionisation) Ionizzazione per desorbimento E' un termine generico che comprende tutte le forme di ionizzazione diretta da un campione solido o liquido (FAB, FI, Californium Fission Ionisation). ESI (Electrospray Ionisation) Ionizzazione elettrospray E' la ionizzazione prodotta spruzzando un campione in soluzione attraverso un capillare tenuto ad alto potenziale. EI (Ionizzazione elettronica) Ionizzazione prodotta in fase gassosa per interazione con un fascio di elettroni. FAB (Fast Atom Bombardment) or LSIMS (Liquid Surface Ionisation MS) Ionizzazione dovuta all'impatto con un fascio di atomi e/o ioni prodotti da un cannone ionico in una matrice liquida con trasferimento di energia dalla matrice all'analita. FD/FI (Field Desorption/Field Ionisation) La formazione di ioni per rimozione di elettroni in un potente campo elettrico.Spettrometria per mobilità ionica.Ioni a pressione atmosferica sono fatti derivare in un tubo sotto l'influenza di un potenziale elettrico. Si separano in base alla loro carica, massa e soprattutto dimensione e forma. Questo dispositivo è spesso accoppiato con un analizzatore di massa per il rilevamento degli ioni e per la misurazione del loro rapporto massa su carica.
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) Ionizzazione ottenuta per effetto dell'irraggiamento con un raggio laser (di solito a vapori d'azoto) che eccita una matrice contenente piccole quantità di analita. NICI (Negative Ion Chemical Ionisation) Ionizzazione chimica a ioni negativiIonizzazione dovuta alla sottrazione di un elettrone nella fase gassosa. Soft ionization o Ionizzazione smorzata Insieme di metodi che portano alla formazione di ioni con bassa energia interna. (CI, FAB, MALDI, ESI, ApCI) TI (Thermal Ionisation) o Ionizzazione termicaIonizzazione provocata da alte temperature in un campione gassoso per mezzo di microonde o indotto da plasma. TSP (Thermospray Ionisation) Ionizzazione per vaporizzazione ad alte temperatureIonizzazione prodotta per nebulizzazione di una soluzione del campione attraverso un capillare conduttivo ad alta temperatura./dd>
Analizzatori Lineari Singola focalizzazione (Single focusing) Viene utilizzato solo un campo magnetico per separare gli ioni in accordo con la loro massa/carica. Doppia focalizzazione (Double Focussing) Una combinazione di campi elettostatico (E) e magnetico (B) vengono usati per compensare le variazioni di energia degli ioni formati nella sorgente e quindi migliorare la risoluzione (qv) dell'analizzatore. E La sigla usata per indicare il voltaggio in un analizzatore elettrostatico. Q L'abbreviazione per un analizzatore a quadrupolo. q La sigla usata per una camera di collisione a quadrupolo solo Rf. V Voltaggio di accelerazione (Accelerating Voltage) Il voltaggio applicato alla sorgente per accelerare nell'analizzatore gli ioni.
Scansione (Scanning) Strumenti magnetici sono analizzati variando il campo magnetico o il voltaggio di accelerazione. Scansioni collegate (Linked Scans) Particolari scansioni dove le funzioni di B e E sono variate {Quadrupolo Quadrupole(Q)} L'applicazione di una combinazione di un voltaggio in corrente continua e alternata a 4 barre parallele che creano un filtro attraverso il quale, con applicazione di un appropriato voltaggio, solo gli ioni di un definito valore di massa/carica possono essere trasmessi. Se si applica la sola radiofrequenza {Rf tutti gli ioni sono trasmessi (q)}. Tempo di volo {TOF (Time-of-Flight)} Gli ioni formati sono tutti accelerati da un potenziale pulsato in un tubo tenuto a bassa pressione (regione di deriva) e il loro tempo di arrivo ad un rilevatore è misurato. Il tempo impiegato è funzione dalla loro massa/carica. Tempo di volo riflesso (Reflectron TOF) Gli ioni che passano nel tubo di volo sono riflessi da uno "specchio" elettrostatico; ciò focalizza gli ioni con differente energia cinetica ma con identica m/z, portando ad una maggiore risoluzione.
TOF ad estrazione ritardata {DE TOF (Delayed Extraction Time-of-Flight)} Una tecnica usata in spettrometria di massa nella quale una migliore risoluzione si ottiene applicando un ritardo controllato fra la formazione degli ioni e la loro accelerazione. TLF-TOF (Time Lag Focussing-Time-of-Flight) Sinonimo di TOF ad estrazione ritardata. Decomposizione dopo la sorgente (PSD - Post Source Decay) E' il processo di frammentazione che può avvenire nel TOF. TOF ortogonale (Orthogonal TOF) In alcuni strumenti più recenti il fascio di ioni è analizzato in un tubo di volo in direzione ortogonale (ad angolo retto) rispetto alla loro traiettoria originale. Esapolo (Hexapole) Un piccolo dispositivo a sei barre usato per focalizzare un fascio di ioni divergente. FWHM (Full Width at Half Height) E' la risoluzione misurata come rapporto tra l'altezza del picco m/z e la sua larghezza a metà dell'altezza.
Trappola ionica Gli ioni sono spinti in un dispositivo tridimensionale dove sono accumulati da un campo generato da un quadrupolo. Sono poi espulsi in base alla m/z per applicazione di un determinato campo elettrico secondario. ICR (Ion Cyclotron Resonance)(FTICR) Gli ioni sono tenuti in "trappola" da una combinazione di campi elettrici e magnetici. Gli ioni sono analizzati in situ grazie agli impulsi elettrici creati dagli ioni circolanti e rilevati da rilevatori a piastre posti esternamente alla trappola. La m/z viene determinata grazie ad una operazione matematica ( FT Fourier Transform) che converte le frequenze misurate in m/z. Diagramma di stabilità di Mathieu Una rappresentazione grafica dei valori dei voltaggi DC e AC i quali, quando applicati a una trappola ionica, mantengono uno ione di un dato intervallo di valori m/z in una traiettoria stabile nella trappola. Risoluzione E' il termine che definisce la prestazione di un analizzatore. Questo parametro quantifica come i picchi di due ioni di m/z adiacente possono essere distinti fra loro con definito valore di sovrapposizione. Di solito si ha 10% per uno strumento ibrido e 50% per i quadrupoli. Per i picchi isolati lo stesso termine può essere calcolato dall'ampiezza del picco ad una definita altezza (FWHM)
Configurazioni con più di un analizzatore MS/MS L'uso di due analizzatori per rilevare gli ioni precursori e i loro prodotti ionici (Tandem Mass Spectrometry). Decomposizione indotta da una superficie SID (Surface Induced Decomposition) Frammentazione di uno ione per collisione con una superficie solida posta tra due analizzatori. Tandem Mass Spectrometry L'uso di due analizzatori separati da una regione in cui gli ioni sono indotti a frammentare per trasferimento di energia (spesso per collisione con altre molecole). Triplo quadrupolo (QqQ, 'Triple quad') Due analizzatori di massa a quadrupolo separati da una camera di collisione con quadrupolo a solo Rf. Qq-TOF Analizzatore a quadrupolo e TOF con una camera di collisione con quadrupolo a sola Rf.
Rilevatori Coppa di Faraday Rileva gli ioni per impatto diretto su una coppa metallica. Elettromoltiplicatore o fotomoltiplicatore Rilevamento degli ioni per produzione di una corrente elettrica amplificata conseguenza del diretto impatto dello ione sulla superficie o per la produzione di fotoni da un fosforo seguito da un tubo fotomoltiplicativo. Microchannel Plate Rilevatore moltiplicatore di elettroni con risposta veloce e area relativamente vasta su cui gli ioni sono rilevati di uso comune negli analizzatori TOF. Data Systems Strumento informatico che processa e registra i segnali provenienti dal rilevatore e gestisce tutti i processi coinvolti nelle operazioni dello strumento. Centroide (Centroid) Il segnale analogico dal rilevatore è trasformato in digitale. Il centroide è il centro del segnale digitalizzato per uno ione da questo è calcolata la m/z per lo spettro. MCA (Multi Channel Analysis) Una media generata dal computer di un certo numero di scansioni dello spettro che si genera da dati continui.
Lo spettro Unità di massa atomica (u) Il simbolo per la massa di una particella basata sul 12C = 12u. Massa su carica (m/z) Il rapporto della massa su carica di uno ione rilevato. La carica (z) è spesso pari a uno ma può essere multipla specialmente in ESI-MS. Spettro di massa Un diagramma della m/z o massa (ascissa) contro l'intensità spesso normalizzata al 100% in base allo ione più intenso rilevato (ordinata). Si produce per selezione della trasmissione degli ioni nell'analizzatore (o rilascio da una trappola) per definiti intervalli di valori m/z in un dato periodo di tempo. Picco base Lo ione più intenso rilevato nello spettro. Spettro continuo Visione grafica del profilo del segnale rilevato per uno ione. Corrente totale degli ioni {Total Ion Current (TIC)} La misura della quantità di tutti gli ioni rilevati.
Ioni isobarici Ioni con identica massa ma con differente composizione atomica. Ione molecolare Lo ione formato a partire dalla molecola originaria nella sorgente. Ione radicale Uno ione contenente un elettrone spaiato. Ioni prodotto, ioni figli o ioni frammento Tutti termini usati per ioni formati per frammentazione di uno ione precursore. Ioni pseudomolecolari Sono ioni formati per ionizzazione delicata, per cui gli ioni molecolari hanno un protone o altri cationi adesi o, per ioni negativi, hanno perso un protone. Isotopi Molti elementi sono composti di una miscela di isotopi che risultano separati in uno spettrometro di massa. Gli atomi o le molecole contenenti tali elementi mostreranno un gruppo di ioni che riflettono la composizione isotopica. Ioni monoisotopici Sono ioni che contengono solo l'isotopo più abondante (chiamato anche lo ione principale).
Massa ionica nominale La massa di uno ione contenente l'isotopo più abbondante, calcolata con il peso atomico nominale. Massa ionica monoisotopica La massa di uno ione contenente gli isotopi più abbondanti calcolata con la massa atomica esatta. Massa media La massa di una particella o molecola di una data formula empirica calcolata usando il peso atomico per ogni elemento. Massa Accurata Gli isotopi hanno un'unica massa precisa, una conseguenza di ciò è che la composizione in elementi di ogni molecola, o suo frammento, può essere calcolata dalla massa se è determinata con sufficiente accuratezza. SIR (Selected Ion Recording) Analisi per definiti analiti, l'analizzatore è impostato per trasmettere solo la m/z calcolata per certi componenti. SIM (Selected Ion Monitoring) Sinonimo di SIR MS/MS (Mass Spectrometry/Mass Spectrometry) Analisi della relazione fra gli ioni e i loro frammenti usando due o più analizzatori o una trappola ionica e usando CAD. Frammentazione Un termine alternativo per decomposizione ionica.
Decomposizione unimolecolare Descrive la frammentazione spontanea di uno ione, avviene nella sorgente. Metastable Ion Ione che si decompone in un prodotto carico e in una specie neutra durante la trasmissione attraverso lo spettrometro. Decomposizione attivata da collisione (CAD) La frammentazione di uno ione indotta dalla collisione con un atomo o una molecola neutra. Camera di collisione Una regione di pressione relativamente elevata contenente un dispositivo di focalizzazione dove avviene la CAD. Scansione degli ioni prodotto Scansioni in cui gli ioni prodotto formati per decomposizione di ioni precursori sono rilevati. CAD o decomposizione unimolecolare sono coinvolti in questo processo. Scansione degli ioni precursori Analisi per tutti gli ioni precursori di un definito prodotto ionico. Scansione di una perdita neutra costante Analisi di ogni ione che perde una certa massa (es. 18 per perdita di H2O). Trasformata di Fourier (FT - Fourier Transform) L'operazione matematica usata per convertire il segnale rilevato in uno spettrometro di massa IRC in valori di m/z.
Sistemi di introduzione del campione Le tecniche di ionizzazione disponibili permettono l'interfacciamento allo spettrometro di massa di numerosi sistemi di introduzione del campione. I campioni solidi volatili possono essere introdotti nella camera di ionizzazione per impatto elettronico attraverso una sonda riscaldabile a tenuta di vuoto. Prodotti non volatili (ad esempio proteine) possono essere sciolti in un solvente adatto ed analizzati con un sistema di ionizzazione a pressione ambiente, ad esempio con la tecnica termospray. Particolarmente interessante e' l'interfacciamento con un sistema cromatografico. In gas-cromatografia, l'effluente da una colonna capillare puo' essere inviato direttamente nella camera di ionizzazione per impatto elettronico. L'effluente da un sistema HPLC puo' essere inviato ad un sistema di ionizzazione chimica a pressione ambiente, termospray o ion-spray, in funzione delle sostanze da analizzare.