visibile e nell’ultravioletto Spettroscopia di assorbimento nel visibile e nell’ultravioletto Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici uso laboratorio ver. 00

I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla misura della radiazione elettromagnetica prodotta o assorbita dagli analiti. Si possono classificare in funzione della regione dello spettro elettromagnetico (raggi X, ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e storicamente i primi metodi spettroscopici erano ristretti all’uso della radiazione visibile.

La spettroscopia costituisce un potente strumento di analisi chimica poiché ogni elemento chimico, ed in generale ogni sostanza, presenta uno spettro caratteristico che fornisce informazioni dettagliate e precise sulla sua struttura o sulla sua composizione.

La luce viene emessa o assorbita sotto forma di quanti o fotoni. L'energia E di un singolo fotone è direttamente proporzionale alla frequenza di radiazione  e quindi inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda , secondo la formula: E = h = hc/ h costante di Planck c velocità della luce Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Si definisce lunghezza d’onda (λ) la distanza minima tra due punti in fase e viene espressa in: Å = 10-8 cm (raggi X) μm = 10-4 cm (IR) nm = 10-7 cm (UV-Visibile) La frequenza rappresenta il numero di oscillazioni al secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un punto nell’unità di tempo e viene espressa in sec-1.

Il colore o la lunghezza d’onda dei quanti di luce emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da una molecola, dipende dalla loro struttura interna. In un atomo, l’assorbimento o l’emissione di luce di una determinata lunghezza d’onda corrisponde alla transizione di un elettrone da un’orbita ad un’altra. Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade nell’intervallo di frequenze dall’infrarosso al visibile. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

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TECNICHE SPETTROSCOPICHE Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

espresso anche come numero d’onda 1/l ≈ 10-380 nm (UV) ≈ 380-780 nm (Vis) ≈ 1-1000 mm (IR) espresso anche come numero d’onda 1/l ≈ 10.000-10 cm Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO Quando una radiazione d’onda compresa tra 190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli elettroni dei legami dei composti presenti in soluzione passano allo stato eccitato. Meno fortemente sono legati gli elettroni dei lagami entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza d’onda della radiazione assorbita e quindi più bassa l’energia. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

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ECCITAZIONE DELL’ETILENE Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Quando un fascio di radiazione monocromatica attraversa una soluzione contenente un analita, parte della radiazione viene assorbita: P0 = intensità radiazione incidente P = intensità radiazione emessa b = spessore dello strato di soluzione Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Transmittanza T = P / P0 Assorbanza A = log 1 / T A = log P0 / P Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

A= e b c LEGGE DI LAMBERT-BEER A = assorbanza = assorbività molare (l mol-1 cm-1) b = cammino ottico (spessore cuvetta espresso in cm) c = concentrazione, espressa in mol l-1 Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Se si riporta il segnale (T o A) in funzione della lunghezza del cammino ottico: La risposta dell’assorbanza in funzione della concentrazione è lineare fino ad un certo punto: Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

I cromofori Sono gruppi presenti in molecole organiche che hanno la capacità di assorbire la radiazione elettromagnetica nella regione del visibile e in quella dell’ultravioletto. I cromofori più comuni sono caratterizzati da gruppi insaturi in grado di delocalizzare le cariche (etileni, acetileni, dieni, carbonili, azoico, benzeni…). Gruppi in grado di esaltare l’attività del cromoforo vengono denominati auxocromi. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Caratteristiche di alcuni cromofori benzenici Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Le variazioni dello spettro SPOSTAMENTO DENOMINAZIONE Lunghezze d’onda maggiore batocromico Lunghezze d’onda minore ipsocromico Assorbanza maggiore ipercromico Assorbanza minore ipocromico Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Lo spettro UV-VIS QUERCETINA 0 Abs 2 200 nm 600 Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Lo spettro UV-VIS Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

LO SPETTROFOTOMETRO Singolo raggio Doppio raggio Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

La sorgente luminosa è costituita da lampada a: deuterio per la zona dell’UV D2 + Ee → D2* → D’ + D’’ + hv (U.V.) spettro della radiazione emessa: ≈ 160-375 nm tungsteno (W) per la regione visibile temperatura filamento: ≈ 2870 K spettro della radiazione emessa: ≈ 350-2500 nm xenon (Xe) per coprire entrambe le zone Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Il monocromatore scinde la luce nelle sue lunghezze d’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il prisma e il reticolo di diffrazione: Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Il rivelatore permette di trasformare l’intensità luminosa in un segnale elettrico. Possono essere utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatori (PMT, photomultiplier tubes, b) o fotodiodi. b Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

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Spettrofotometro con rivelatore a serie di diodi Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

LE CUVETTE lati opachi Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Lampada: singola sorgente pulsata allo Xenon Intervallo: 190-1100nm Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

La taratura Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Differenza spettri Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

L’influenza del pH Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Spettri in derivata Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Rilascio di un farmaco da una formulazione Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI) Grazie allo sviluppo di opportuni software, gli attuali spettrofotometri possono essere utilizzati come colorimetri, apparecchi che sono in grado di misurare la radiazione luminosa e fornire un dato numerico che corrisponde alla sensazione visiva percepita dall’occhio umano. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione è possibile effettuare una scansione tra 380 e 780nm, impostare l’osservatore standard e il tipo di sorgente (in genere 10° e D65, rispettivamente) ottenendo i valori di coordinate cromatiche nel sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o L*C*H*. In tale modo vengono valutati l’intensità, la tinta e la saturazione senza bisogno di strumenti più costosi muniti della sfera. Poiché il colore viene influenzato dalle diluizioni, nel caso di campioni molto intensi è preferibile ricorrere a celle dal cammino ottico inferiore ed effettuare le opportune correzioni. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

I parametri di misura del colore Tinta (Hue, h) = definisce la tonalità del colore (rosso, giallo, verde, azzurro) Luminosità (L*): indica la diversa intensità di luce, ossia di quanto la tinta è diluita con il nero. Varia da zero (nero) a 100 (bianco) Saturazione (Chroma, C*): indica di quanto la tinta pura è diluita con il bianco. Varia da zero (bianco) a 100 (colori spettrali puri, luci monocromatiche) Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

LA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIO Spazio CIE xy (1931) Spazio CIE L*a*b* (1976) Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Lo spazio CIE L*a*b* saturazione tinta, tonalità luminosità Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

LA FUORIMETRIA Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si parla di fluorescenza, processo che dura tra 10-10 s e 10-5 s ed è indipendente dalla temperatura. Si parla di fluorescenza primaria quando la sostanza è fluorescente allo stato naturale, mentre la fluorescenza secondaria deriva dalla reazione con sostanze fluorescenti (derivatizzazione). Le molecole naturalmente fluorescenti sono quelle con sistemi fortemente coniugati o aromatici e struttura rigida. Il picco di emissione si trova sempre a lunghezza d’onda maggiori (spostamento di Stokes), e pertanto, a energia più bassa. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

FUORIMETRI Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza molecolare (spettrofluorimetri) sono simili allo spettrofotometro UV-VIS: è presente una sorgente luminosa (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto alla luce incidente. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni accorgimenti tecnici, ad es. l’assenza di fluorescenza provoca il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) o da sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di pH, temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si eseguono diluizioni pari a 10-100 volte rispetto a quelle utilizzate in spettrofotometria UV-VIS. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

SPETTROSCOPIA NELL’INFRAROSSO È una tecnica molto utilizzata per identificare composti organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza delle molecole presenta spettri di assorbimento caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer. processo che dura tra 10-10 s e 10-5 s ed è indipendente dalla temperatura. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

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Il gran numero di legami presenti nelle molecole poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall’analisi IR siano molto complessi e forniscano un’impronta digitale di identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare molecola. Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

GRUPPO LEGAME ENERGIA (approx, cm-1) hydroxyl O-H 3610-3640 amines N-H 3300-3500 aromatic rings C-H 3000-3100 alkenes 3020-3080 alkanes 2850-2960 nitriles C ΞN 2210-2260 carbonyl C=O 1650-1750 C-N 1180-1360 Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IR sistemi a dispersione Globar Lampada di Nernst Filo Ni-Cr Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IR sistemi a trasformata di Fourier Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

GLI SPETTRI IR Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

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