Le tecniche della biologia molecolare

Le tecniche della biologia molecolare Lezione 4

Domanda! Perché dopo un vaccino ci si può sentire poco bene? Prova tu a rispondere e poi continua a leggere….

La biologia molecolare Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità La biologia molecolare Studia le molecole complesse presenti nella cellula Tecniche della biologia molecolare DNA, RNA e PROTEINE Prese da altre discipline (genetica, fisica, biochimica, …) Applicate nell’ingegneria genetica e in biotecnologie

Il DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità L’ingegneria genetica nasce dalla possibilità di trasferire brevi segmenti di DNA di un organismo al DNA di un organismo diverso. La TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE permette di creare e duplicare geni e proteine, isolando e ricombinando fra loro segmenti di DNA di diversa provenienza.

Il DNA ricombinante 4 FASI FASE 1: Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità 4 FASI FASE 1: Estrarre il DNA e frammentarlo in segmenti definiti FASE 2: Isolare il segmento contenente il gene di interesse FASE 3: Amplificare i frammenti di interesse FASE 4: Trasferire il segmento di DNA all’interno di una cellula ospite, dove quel gene verrà duplicato ed espresso

Fase 1: Estrarre il DNA e frammentarlo in segmenti definiti Il DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Fase 1: Estrarre il DNA e frammentarlo in segmenti definiti Per tagliare il DNA si utilizzano enzimi di restrizione che individuano e tagliano la molecola di DNA solo in particolari siti caratterizzati da una sequenza di basi azotate. Sono stati scoperti molteplici tipi di enzimi di restrizione che permettono di tagliare la molecola di DNA ciascuna in una specifica sequenza di basi azotate

Il DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Fase 2: Isolare il segmento contenente il gene di interesse Differenze nel DNA di ogni organismo: anche le sequenze di DNA omologhe sono diverse I segmenti tagliati, detti frammenti di restrizione, hanno lunghezze disuguali RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): polimorfismi dei frammenti di restrizione Tecnica di separazione: ELETTROFORESI SU GEL

Il DNA ricombinante Tecnica di separazione: ELETTROFORESI SU GEL Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Tecnica di separazione: ELETTROFORESI SU GEL I segmenti di DNA hanno Il gel serve da supporto e da setaccio molecolare È immerso in un capo elettrico carica negativa data dai gruppi fosfato Diversa lunghezza (e peso) I frammenti più piccoli si muovono con velocità maggiore I segmenti vengono separati in base alla minore/maggiore migrazione all’interno del gel

DNA ricombinante - applicazioni Il DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Fase 3: Amplificare i frammenti di interesse Non sempre si ha a disposizione abbastanza DNA per applicare l’analisi dei frammenti di restrizione … … … … … … … … I ciclo II ciclo III ciclo 1 molecola 2 molecole 22 = 4 23 = 8 molecole PRC (Polymerase Chain Reaction): tecnica che permette di amplificare (clonare) in provetta un segmento di DNA Il DNA da duplicare viene denaturato (separazione dei due filamenti) e aggiunto a una miscela formata da monomeri di nucleotidi e DNA-polimerasi (enzimi) Ad ogni ciclo ciascun filamento viene completato dal suo complementare, duplicando il DNA di partenza

Il DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Fase 4: Trasferire il segmento di DNA all’interno di una cellula ospite, dove quel gene verrà duplicato ed espresso Le cellule in cui è più facile inserire il DNA sono i batteri. DNA batterico BATTERIO DNA estraneo Spesso inserito sotto forma di plasmide Nei batteri è presente un'unica molecola di DNA circolare a doppia catena, per questo motivo risulta più semplice trasferirvi segmenti di DNA estranei.

Molte proteine codificate dal gene Il DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Tramite la clonazione si possono ottenere copie del batterio modificato. DNA ricombinato Molte copie del gene Molte proteine codificate dal gene Si può quindi estrarre dai batteri le copie dei geni oppure ottenere le proteine codificate dal gene inserito.

Il DNA ricombinante: applicazioni Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Le applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante sono molteplici e anche in futuro questa tecnica, insieme ad altre tecniche di biologia molecolare, potranno portare progressi notevoli in svariati campi. MEDICINA: Produzione dell’insulina Sintesi di vaccini e farmaci Fecondazione artificiale AGRICOLTURA: Creazioni di piante più resistenti Eliminazione di rifiuti tossici INDUSTRIA: Produzione di vitamine per la cosmesi Produzione di biocarburanti

Vaccini Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità I vaccini si basano su due caratteristiche del sistema immunitario Specificità Memoria Per ogni antigene (sostanza estranea) si attiva una specifica risposta immunitaria In seguito alla risposta primaria alcuni globuli bianchi che fungono da memoria Se si ricontrae la malattia il sistema immunitario è pronto a reagire creando velocemente gli anticorpi

Vaccini Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità I vaccini Sono microrganismi patogeni (responsabili dell’insorgenza della malattia). Trattati in modo da: Provocano una infezione minima (che non fa insorgere la malattia) Non fa insorgere la malattia Scatena la risposta immunitaria primaria Mantenere le proprietà antigene (che stimolano il sistema immunitario alla produzione di anticorpi) perdere le proprietà infettive Si creano i globuli bianchi che difendono dalla malattia Antigeni = falsi invasori che scatenano la risposta immunitaria

Vaccini a DNA Vaccini basati sulla tecnologia del DNA ricombinante Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Vaccini basati sulla tecnologia del DNA ricombinante Non viene iniettato direttamente l’antigene Sperimentazioni per vaccini antitumorali Viene iniettato un batterio con DNA ricombinato che contiene il gene che codifica l’antigene L’organismo stesso produce l’antigene Migliore risposta immunitaria

Alcuni tipi di vaccini Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Esistono quindi diversi tipi di vaccini, a seconda della modalità in cui vengono preparati vaccini da microrganismi vivi/attenuati vaccini da microrganismi inattivati vaccini sintetici Vaccini di 2° generazione Immunizzazione contro la tossina in questione tramite la produzione in laboratorio di una antitossina Prodotti dell’ingegneria genetica o da tecniche come quella del DNA ricombinante Microrganismi in condizioni particolari Microrganismi uccisi Esempio: Vacc. Morbillo, Vacc. Poliomielite (Sabin) Esempio: Vacc. Poliomielite (Salk) Esempio: Vacc. Tetano Esempio: Vacc.Epatite B Esistono 2 vaccini per la Poliomielite

Vaccini: Curiosità Introduzione DNA ricombinante DNA ricombinante - applicazioni Vaccini Alcuni tipi di vaccini Vaccini: curiosità Può succedere che i giorni seguenti a un vaccino ci si senta spossati. Il vaccino infatti è spesso ricavato da un organismo patogeno ma inattivato in modo da scatenare la reazione immunitaria primaria senza causare la malattia. Dopo aver fatto il vaccino però i nostri anticorpi saranno pronti a difenderci da un reale contagio.

Le tecniche della biologia molecolare ESERCIZI

Le tecniche della biologia molecolare Completa lo schema della tecnica del DNA ricombinante con le seguenti parole: Trasferimento del DNA ricombinante Fase 1 …………… Estrazione e frammentazione del DNA Fase 2 …………… Fase 3 Amplificazione del DNA …………… Fase 4 …………… Isolamento del segmento di DNA

Soluzione Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 Estrazione e frammentazione del DNA Fase 1 Isolamento del segmento di DNA Fase 2 Amplificazione del DNA Fase 3 Fase 4 Trasferimento del DNA ricombinante

Le tecniche della biologia molecolare Indica se ogni affermazione è vera (V) o falsa (F): Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per duplicare il DNA □ V □ F Gli enzimi di restrizioni riconoscono particolari sequenze di DNA Tutti i segmenti di DNA isolati hanno la stessa lunghezza L’elettroforesi su gel permette di separare i frammenti di DNA I frammenti di DNA hanno carica negativa data dai gruppi fosfato La PCR avviene in una miscela di monomeri di nucleotidi e DNA polimerasi I batteri con DNA ricombinato perdono la possibilità di duplicarsi La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso di sintetizzare particolari proteine La memoria è una caratteristica del nostro sistema immunitario I vaccini sono trattati in modo da perdere le proprietà antigene Il vaccino antitetanico è ottenuto creando in laboratorio un’antitossina

Soluzione Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per duplicare il DNA □ V □ F Gli enzimi di restrizione riconoscono particolari sequenze di DNA Tutti i segmenti di DNA isolati hanno la stessa lunghezza L’elettroforesi su gel permette di separare i frammenti di DNA I frammenti di DNA hanno carica negativa data dai gruppi fosfato La PCR avviene in una miscela di monomeri di nucleotidi e enzimi I batteri con DNA ricombinato perdono la possibilità di duplicarsi La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso di sintetizzare particolari proteine La memoria è una caratteristica del nostro sistema immunitario I vaccini sono trattati in modo da perdere le proprietà antigene Il vaccino antitetanico è ottenuto creando in laboratorio un’antitossina

Le tecniche della biologia molecolare Individua la risposta corretta: Partendo da una molecola di DNA, dopo 4 cicli quante molecole di DNA produce la PCR? A) 2 B) 4 C) 16 D) 32 Un vaccino ha il compito di: A) scatenare la difesa immunitaria secondaria B) scatenare la difesa immunitaria primaria C) curare una malattia D) creare globuli rossi Quali di questi vaccini è creato da microrganismi vivi/attenuati? A) Vaccino antitetanico B) Vaccino contro il morbillo C) Vaccino contro l’epatite B D) Nessuno dei precedenti

Soluzione Partendo da una molecola di DNA, dopo 4 cicli quante molecole di DNA produce la PCR? A) 2 B) 4 C) 16 D) 32 Un vaccino ha il compito di: A) scatenare la difesa immunitaria secondaria B) scatenare la difesa immunitaria primaria C) curare una malattia D) creare globuli rossi Quali di questi vaccini è creato da microrganismi vivi/attenuati? A) Vaccino antitetanico B) Vaccino contro il morbillo C) Vaccino contro l’epatite B D) Nessuno dei precedenti

Le tecniche della biologia molecolare Inserisci nel riquadro verde l’esempio corretto: Tipologie di vaccini vaccini da microrganismi vivi/attenuati vaccini da microrganismi inattivati Vaccini di 2° generazione vaccini sintetici Vacc. Poliomielite (Salk) Vacc. Poliomielite (Sabin) Vacc. Tetano Vacc.Epatite B

Soluzione Inserisci nel riquadro verde l’esempio corretto: Tipologie di vaccini vaccini da microrganismi vivi/attenuati vaccini da microrganismi inattivati Vaccini di 2° generazione vaccini sintetici Vacc. Poliomielite (Sabin) Vacc. Poliomielite (Salk) Vacc.Epatite B Vacc. Tetano