METODI IMMUNOMETRICI (I) I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse. complesso antigene-anticorpo campione + anticorpo quantificazione del

METODI IMMUNOMETRICI (II) L’avidità del legame antigene-anticorpo si misura con la costante di equilibrio (Keq). Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq = 109-1012 M-1 Per confronto, si riportano le costanti di affinità di alcuni complessi tra uno ione metallico ed EDTA, un legante poliamminocarbossilico, che forma complessi chelati molto stabili con numerosi ioni metallici. KM-EDTA AgEDTA3- CaEDTA2- FeEDTA2- HgEDTA2- 107 M-1 1010 M-1 1014 M-1 1021 M-1 Complesso EDTA: acido etilendiaminotetracetico

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (I) Caratteristiche fondamentali di un anticorpo sono l’affinità (misurata in termini chimico-fisici dalla costante di equilibrio K) e la specificità (capacità di riconoscere l’analita, distinguendolo da molecole a struttura simile). Gli anticorpi più comunemente utilizzati per lo sviluppo di metodi immunometrici sono le immunoglobuline G (IgG). La molecola, a forma di “Y”, è composta da due catene aminoacidiche leggere e due pesanti. legame Ag sito legame Ag sito variabile costante catena leggera catena pesante

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (II) epitopo paratopo CDR antigene ponte disolfuro intracatena ponte disolfuro intercatena frammento Fab frammento Fc Catena H Catena L In dettaglio è mostrata la porzione Fab dell’anticorpo, con il sito di legame con l’antigene. Si può vedere come in questa porzione dell’anticorpo, perfettamente complementare all’antigene, siano presenti dei gruppi funzionali che stabiliscono numerose interazioni con l’antigene.

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (I) L’interazione antigene-anticorpo interessa porzioni limitate delle due molecole. Antigene Anticorpo

COME SI OTTIENE UN ANTICORPO Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). In questo caso viene chiamato antigene. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. L’antigene viene somministrato Dal siero dell’animale si possono purificare le IgG totali (ricche in IgG anti-antigene somministrato)

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (I) Poiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi, mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. Questi anticorpi sono detti policlonali. È possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo. Per questo occorre, dopo avere immunizzato il topo, isolare i diversi cloni di cellule B e testarli per individuare l’anticorpo migliore. Poiché le cellule B normalmente non crescono in coltura, esse devono essere fuse con cellule di mieloma per ottenere ibridomi in grado sia di crescere in coltura sia di produrre quantità illimitate di anticorpo.

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II) IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI Vantaggi Svantaggi Caratteriestiche (affinità e specificità) note e costanti Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene) Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione Tecniche di produzione più sofisticate E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata Non sempre reagiscono con la proteina A Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene Solitamente caratterizzati da elevata specificità Spesso caratterizzati da bassa affinità

ANTIGENI ED APTENI Sintesi derivato aptene braccio spaziatore aptene carrier + a) Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”, che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene. anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono l’aptene

SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI (II) Esempio: produzione di un anticorpo anti-estradiolo. La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno. estriolo estrone C17 estradiolo 3,8  1,2 % 5,6  2,0 % 48  8 % Reattività crociata 40  10 % 5,0  1,8 % 0,48  0,27 % estrone estriolo C6 C16 C17 Derivatizzazione C16 C6

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI Il legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = dove An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo ed è una misura dell’affinità dell’anticorpo per l’antigene, cioè della forza del legame An-Ab. L’unità di misura per Keq è L mol-1. Anticorpi con Keq  108-109 L mol-1 sono adatti per lo sviluppo di metodi immunometrici.

La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile TRACCIANTI (I) La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile En + S EnS En + P L’interazione enzima-substrato si autorivela attraverso la formazione del prodotto o scomparsa del substrato che hanno proprietà chimiche diverse An + Ab An-Ab La reazione è difficilmente rivelabile se non sfruttando le diverse proprietà fisiche del complesso An-Ab rispetto ad An libero Per esempio: differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o diverse proprietà ottiche misurabili con il sistema Biacore E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile

TRACCIANTI (II) La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

TRACCIANTI (III) Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, quindi di fare avvenire la competizione in presenza di poche molecole, abbassando il limite di rivelazione del metodo. Tra le molecole facilmente rivelabili si può utilizzare: un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA) un enzima (enzyme immunoassay, EIA) un substrato enzimatico un coenzima o un inibitore enzimatico una molecola fluorescente o un quencher

SCELTA DEL TRACCIANTE (I) Amplificazione enzimatica: 1 molecola di enzima 1000 molecole di prodotto Aumenta con: - attività enzimatica - rivelabilità del prodotto - amplificazione ciclica Chemiluminescenza Analita—Enzima Substrato Prodotto Spettrofotometria Fluorescenza Analita—125I emissione  1 disintegrazione/sec molecole (106) Analita—Chemilum. Reaz. chimica Ic h Ic aumenta con: CL (resa quantica) f (rapporto molecole chemilum/analita) Ic = f c CL Analita—Fluoroforo I0 h If h’ If aumenta con: I0 (intensità del raggio di eccitazione)  (coefficiente di estinzione) c (concentrazione) If = I0  F cd

SCELTA DEL TRACCIANTE (II) TRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONE Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa (10-12-10-20 g) e facilmente rivelabile 10-13 – 10-15 Chemiluminescenza Molecola chemiluminescente 10-12 – 10-14 Fluorescenza Molecola fluorescente 10-20 – 10-21 Amplificazione ciclica enzimatica 10-15 – 10-18 10-16 – 10-18 Bio-chemiluminescenza 10-15 – 10-16 Assorbanza Enzima 0.1 – 10 x 10-15 ≈ 10.000 dpm 125I MASSA (moli/tubo) SEGNALE TRACCIANTE

ENZIMI Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo Sono caratterizzati da: altissima specificità elevato potere catalitico E + S ES E + P

COFATTORI ENZIMATICI L’attività di alcuni enzimi dipende soltanto dalla struttura proteica, mentre altri richiedono anche uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori Il cofattore può essere: uno ione metallico una molecola organica chiamata coenzima

UNITÀ DI MISURA Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica (o attività enzimatica) L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.) Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato in condizioni standardizzate

EFFETTO DEL pH sull’attività enzimatica 6 8 10 tripsina colinesterasi 4 papaina 2 pepsina pH attività enzimatica relativa Il profilo a campana è il più comune

EFFETTO DELLA TEMPERATURA sull’attività enzimatica T (°C) attività enzimatica relativa 20 40 60 Gli enzimi hanno diversa stabilità termica La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica

METODI DI MISURA La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse Tali proprietà devono poter essere misurabili I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: spettrofotometrici spettrofluorimetrici

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (I) Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (III) Un enzima ideale per lo sviluppo di un EIA deve essere: sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA. Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente si esprime in unità per mg (U/mg).

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (IV) Vantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (I) L’attività enzimatica viene misurata valutando la velocità della reazione enzimatica in condizioni di eccesso di substrato. Si può scegliere di misurare la velocità di scomparsa del substrato o quella di comparsa del prodotto. Il secondo metodo è preferibile poiché la misura è più accurata (ad es. da 0 a 1% per la comparsa del prodotto, da 100% a 99% per la scomparsa del substrato), soprattutto considerando che occorre lavorare in condizioni di eccesso di substrato. La misura del prodotto della reazione enzimatica è proporzionale alla concentrazione dell’enzima se: - l’andamento della reazione è lineare nel tempo - l’attività enzimatica è proporzionale alla quantità assoluta di enzima.

TRACCIANTI ENZIMATICI SISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

SPETTROFOTOMETRIA (I) L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile. SUBSTRATO ENZIMA PRODOTTO c A P0 P b P T = bc T 1 log A e =

SPETTROFOTOMETRIA (II) 2,3-diamminofenazina (DAP) ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO N H 2 perossidasi H2O2 o-fenilendiammina 2,3-diamminofenazina (DAP) arancio max=492 nm

FLUORESCENZA (I) SUBSTRATO PRODOTTO Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare  è il rapporto tra il numero di molecole che emettono la fluorescenza ed il numero totale di molecole eccitate (o il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti): dove Rf è la velocità di rilassamento fluorescente e Rr è la velocità di rilassamento non-radiativo. ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente. La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate, successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni.

FLUORESCENZA (II) E 1 2 Assorbimento molecolare l 5 Energia ’ Conversione interna Rilassamento vibrazionale Fluorescenza Diagramma energetico parziale di una specie molecolare ipotetica (diagramma di Jablonski)

CHEMILUMINESCENZA (I) Con il termine chemiluminescenza si indica il fenomeno di conversione di energia chimica in radiazione luminosa, di lunghezza d'onda variabile dall'ultravioletto all'infrarosso comprendendo tutto il campo del visibile. Reagenti Intermedio [ Prodotti ]* Prodotti + hn stadio 1 stadio 2 stadio 3 La specie “Intermedio” deve essere molto ricca di energia, in modo da potersi decomporre formando almeno un prodotto in uno stato eccitato. Siccome le reazioni di ossidazione con l'ossigeno molecolare sono molto esoergoniche, esse sono fra le reazioni chemiluminescenti più comuni.

CHEMILUMINESCENZA (II) fotoni emessi molecole reagenti L'efficienza di un processo di chemiluminescenza, CL, è definita dalla relazione: fotoni emessi molecole reagenti CL = Se Int = resa dello stadio 1 (formazione dell'Intermedio), SE = resa dello stadio 2 (formazione dei Prodotti nello stato eccitato) Em = resa quantica dello stadio 3 (emissione di fotoni) l' efficienza del processo di chemiluminescenza è: CL = IntSEEm Poiché la resa di ciascuno stadio del processo é minore di 1, la resa quantica dell'intero processo di chemiluminescenza é sicuramente minore di 1. I valori di resa quantica dei più comuni processi di chemiluminescenza in genere non superano il valore 0,01.

METODI IMMUNOMETRICI Eterogenei Omogenei COMPETITIVI Eterogenei Omogenei NON COMPETITIVI

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (I) I metodi immunometrici possono essere classificati in: segnale log concentrazione analita Competitivi (a modulazione di attività, AM). Si basano sulla modulazione del segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle del tracciante per un numero limitato di siti anticorpali. Il segnale analitico diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione, la curva dose-risposta ha forma sigmoidale. segnale concentrazione analita Non competitivi (ad amplificazione di attività, AA), tutto l’analita presente nel campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato. Il segnale analitico è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la curva dose-risposta è lineare.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (II) I metodi immunometrici possono essere distinti in: Eterogenei (su fase solida). Il metodo di rivelazione non permette di distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero. Questi metodi necessitano di una separazione della frazione libera da quella legata prima della misura, quindi prevedono l’immobilizzazione di un componente (antigene o anticorpo) su una fase solida; in alternativa si può procedere mediante precipitazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando glicole polietilenico o un secondo anticorpo in eccesso. Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (III) CARATTERISTICHE DEI METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei

Fisica (adsorbimento) METODI ETEROGENEI (I) IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I) Chimica Fisica (adsorbimento) IgG anti-analita da coniglio IgG anti-coniglio (Fc specifico) da capra Biotina-avidina Proteina A Anticorpo

METODI ETEROGENEI (II) Fisica (adsorbimento) IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO L’adsorbimento passivo dell’anticorpo sulla fase solida avviene mediante interazioni idrofobiche. Il processo è influenzato da: pH (deve essere vicino al punto isoelettrico dell’anticorpo, in modo che la carica elettrica della molecola Fisica (adsorbimento) tenda a zero); forza ionica (la presenza di sali, che neutralizzano le cariche elettriche, favorisce le interazioni idrofobiche); temperatura (l’aumento della temperatura favorisce la diffusione, quindi rende il processo più rapido); tempo (in genere qualche ora è sufficiente, a temperatura ambiente); concentrazione proteica (se è troppo elevata si formano strati proteici multipli, con conseguente ridotta capacità legante e stabilità, se è troppo bassa si osservano interazioni aspecifiche dell’antigene con la fase solida, le quali tuttavia possono essere note- volmente ridotte saturando la superficie libera del tubo con una proteina (BSA) o un polimero (PVP).

METODI ETEROGENEI (III) IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO Anticorpi di cattura Fc specifici Anticorpi di cattura Fab specifici Gli anticorpi anti-analita sono orientati in maniera ottimale per legare l’antigene Gli anticorpi anti-analita non sono in grado di legare l’antigene

Competitivi METODI IMMUNOMETRICI Competizione tra analita (Ag) presente nel campione e una quantità fissa di tracciante (Ag* marcato) per legarsi ad una quantità fissa e limitante di anticorpo (Ab) [Ag*] = costante [Ab] = costante [Ab] < [Ag] + [Ag*] Ag + Ab  Ab-Ag Ag* + Ab  Ab-Ag* Eterogenei: separazione fisica tra Ag* e Ab-Ag* Omogenei: nessuna separazione tra Ag* e Ab-Ag*

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (I) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (II) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (III) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (IV) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (V) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (VI) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (VII) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (VIII) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (IX) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRETTI E Aggiunta antigene e anticorpo Aggiunta dell’anticorpo marcato Substrato Segnale Competizione per il sito anticorpale Separazione Misura dell’attività enzimatica Anticorpoanti-IgG marcato Analita immobilizzato Anticorpo anti-analita Analita libero E

METODI COMPETITIVI OMOGENEI (I) EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I) Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo.

METODI COMPETITIVI OMOGENEI (I) S P EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II) Sono stati proposti due sistemi. 1° sistema: Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

METODI COMPETITIVI OMOGENEI (I) S P EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III) 2° sistema: Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

METODI COMPETITIVI OMOGENEI (III) ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay) L’analita compete con il tracciante per i siti anticorpali. L’anticorpo è coniugato ad un enzima. S P1 P2 S P1 Q S P1 In presenza di elevate quantità di analita, il tracciante, che non si lega all’anticorpo, interagisce con un enzima in soluzione che trasforma P1 in un prodotto non misurabile (Q). Questo riduce il segnale di fondo. In presenza di piccole quantità di analita, il tracciante interagisce con l’enzima immobilizzato sull’anticorpo, che trasforma P1 in un prodotto misurabile (P2).

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI (II) Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita segnale log concentrazione analita

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (I) La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B0 (rapporto tra segnale dello standard a concentrazione x e segnale ottenuto a dose zero di analita) in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. B0 è il segnale ottenuto in assenza di analita, cioè rappresenta il legame massimo del tracciante alla fase solida. B è il segnale a concentrazione x di analita (solo una frazione di tracciante è legato alla fase solida). B/B0 rappresenta quindi la frazione di tracciante che è stato spiazzato in presenza della concentrazione x di analita ed è compreso tra 0 e 1. B/B0 log concentrazione analita

METODI NON COMPETITIVI Si utilizza un notevole eccesso di immunoreattivo in modo da ottenere il massimo segnale dall’analita. Per la legge di massa la velocità di formazione del complesso antigene-anticorpo è proporzionale alla concentrazione dei reattivi. Ciò implica che anche a bassissima concentrazione di analita un’alta frazione reagirà con l’anticorpo in eccesso. Segnale Concentrazione analita La curva dose-risposta ha un andamento lineare ed il segnale è direttamente proporzionale alla con-centrazione di analita.

Non Competitivi di Tipo “Sandwich” METODI IMMUNOMETRICI Non Competitivi di Tipo “Sandwich” Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag] L’analita deve essere una molecola relativamente grande, con almeno due determinanti antigenici Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (I) Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo di rivelazione Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (II) Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (III) Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (IV) Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (V) Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (VI) Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (VII) Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI (SANDWICH) ETEROGENEI (SU FASE SOLIDA)

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI substrato prodotto intermedio prodotto finale Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale. In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc...

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI Analita Ab marcato 1 Ab marcato 2 E1 E2 Aggiunta reattivi Reazione Misura dell’attività enzimatica 2 Aggiunta Substrato 1 Si utilizzano due enzimi vicinali, tali per cui uno produce il substrato per l’altro (es. glucosio ossidasi/perossidasi) L’attività del secondo enzima è misurabile solo quando i due Ab marcati reagiscono con Ag, avvicinando i siti attivi enzimatici

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando il segnale ottenuto per ciascun standard in funzione della concentrazione di analita nello standard. La curva ideale è lineare. In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione. Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione

METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA) CARATTERISTICHE Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita. L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità Specificità intrinseca superiore Limite di rivelazione più basso Amplificazione di attività (AA) (Metodi non competitivi) Modulazione di attività (MA) (Metodi competitivi)

Competitivi Non Competitivi METODI IMMUNOMETRICI Segnale analitico Log [Analita] Segnale analitico [Analita] Competitivi Non Competitivi

INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

Ab Ag* Ag* Ag Ab* Ab Ag Ab* METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Ab Ag* Ag* Ag Ab* Ab Ag Ab*

(carne, matrici vegetali) METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) ANALISI DIRETTA Campioni solidi (carne, matrici vegetali) OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE ANALISI

METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce

Marcatori METODI IMMUNOMETRICI Isotopi radioattivi (125I, 3H) Molecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti

Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno

METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche - errori precisione e accuratezza - tempi di esecuzione rapidità