FARMACOLOGIA DEL NITROSSIDO

La scoperta dell’EDRF Esperimento di Furchgott e Zawadzski (1980) sulla vasocostrizione di anelli di aorta mantenuti in vitro: ACh 10-8 10-7 10-6 ACh 10-8 W 10-7 10-6 W W NA NA Con endotelio Senza endotelio La rimozione dell’endotelio da preparati vascolari in vitro è in grado di prevenire la VD indotta da ACh. [NA=noradrenalina (=>VC); W= lavaggio] Acetilcolina  rilascio di EDRF (Endothelium-Derived Relaxing Factor) dall’endotelio  rilasciamento cell. muscolari lisce vasali Profilo farmacologico dell’EDRF: T1/2 = pochi sec Azione biologica bloccata da ossi-Hb e anione superossido Mediatore intracellulare: guanilato ciclasi Inibizione dell’aggregazione piastrinica

L’EDRF è il nitrossido Osservazioni preliminari: Analogie (emivita, rilascio e inibizione) con alcuni nitroderivati usati nel trattamento della cardiopatia ischemica (nitroglicerina, isosorbid dinitrato) I macrofagi attivati da endotossine o citochine rilasciano NO (tossico x i microrganismi) L’NO è un potente vasodilatatore L’NO è un potente attivatore della guanilato ciclasi in tessuti cerebrali La fonte di NO è rappresentata dalla L-Arg (Hibbs et al., 1987) La L-Arg incrementa i livelli di cGMP in colture neuronali Moncada et al., 1987: L’EDRF è il nitrossido L’NO è prodotto dal gruppo guanidino terminale della L-Arg durante la sua degradazione enzimatica in L-citrullina Il NO è una molecola potenzialmente importante nella biologia cellulare!

CHIMICA DEL NITROSSIDO L’NO è un radicale libero di azoto presente in condizioni normali come inquinante atmosferico e nel fumo di sigaretta. L’NO è in uno stato intermedio di ossidazione per cui è in grado sia di ossidare che di ridurre i composti chimici con cui viene a contatto. Gruppi o composti chimici con cui l’NO è capace di interagire: Ossigeno Ozono Anione superossido Ossi-Hb e altre emoproteine Composti solforati Amine Tirosina

Interazioni con proteine contenenti gruppi ferro-eme: L’NO interagisce con il ferro (Fe2+) dell’eme producendo nitrosil-eme (cinetiche veloci, legame reversibile). Questa interazione avviene a conc di NO nanomolari (comunemente generate dalle NOS costitutive della cellula). Interazione con due enzimi (recettori intracellulari x l’NO): Guanilato ciclasi solubile: modificazione conformazionale che attiva l’enzima  ↑ cGMP Citocromo c ossidasi: NO interagisce con lo stesso sito di legame per l’ossigeno  inibizione attività enzimatica Inoltre, l’NO interagisce con: Ossiemoglobina: HbFe3+O2 + NO∙ → [HbFe3+--NO] → HbFe2+ + NO3¯ PGH sintasi 1 e 2: attivazione enzimatica

Interazioni con anione superossido (O2-): Interazioni con O2: Formazione di NO2 gassoso o NO2¯ (indice della produzione di NO) In alcune condizioni, l’interazione con O2 porta a S-nitrosazione (trasformazione dei residui SH di proteine e mercaptani a basso PM in residui SNO) Interazioni con O3: NO + O3 → NO2 attivato (chemiluminescenza x determ NO) Interazioni con anione superossido (O2-): NO + O2- → -OONO (perossinitrito) → NO3- I livelli di superossido aumentano in corso di infiammazione Il -OONO media gli eventi patologici indotti dall’NO attraverso la nitrosazione dei gruppi tiolici delle proteine e dei mercaptani intracellulari (es: GSH) e la deprivazione di ferro dai clusters ferro-zolfo (es: enzimi mitocondriali della catena di trasporto elettonico) Interazioni con amine: Linfochine/Endotossine  ⊕ macrofagi  rilascio NITROSAMINE  deaminazione nucleotidi di DNA e RNA  azione battericida, ma anche carcinogenetica su cellule eucariotiche Interazioni con tirosina: Il NO (in gen –OONO) determina nitazione di tirosine => 3-nitrosine (misurate con Ab specifici: indice di produzione di persossinitrito)

BIOSINTESI DEL NITROSSIDO 1) Enzimatica (NOS): meccanismo predominante NOS L- Analoghi della L-Arginina agiscono da falsi substrati della NOS e sono inibitori selettivi della produzione di NO (N-monometil-L-arginina; L-nitroarginina; L-nitroarginina metilestere) 2) Disproporzionamento o riduzione dei nitrati/nitriti (a pH acido: danno tissutale, ipossia/ischemia) NO3- --> NO2- + e- → NO electron-donor systems with the participation of NADH, NADPH, flavoproteins, and cytochrome oxidase in mitochondria and by NADH, NADPH, flavoproteins, and cytochrome P-450 in endoplasmic reticulum

un dominio eme (mono-ossigenasi tetraidrobioperina-dipendente) Gli isoenzimi della NO sintasi (i-NOS, e-NOS, n-NOS) sono lunghi polipeptidi contenenti tre domini principali: un dominio eme (mono-ossigenasi tetraidrobioperina-dipendente) un dominio intermedio che lega la calmodulina (dominio regolatorio) un dominio con attività reduttasica NADPH-dipendente (C-terminale - elevata omologia con la cyt-P450 reduttasi) O tetraidrobiopterina La conversione di arginina in citrullina consiste di due fasi che utilizzano NADPH e ossigeno: 1) reazione di N-ossidazione con formazione di N-idrossi-arginina 2) rottura del legame C-N e formazione di NO La NOS per funzionare ha bisogno di 5 cofattori: NADPH (fornisce gli elettroni), FAD e FMN (trasferimento e riserva di elet-troni), BH4 (trasferimento elettroni al gruppo eme?), Ca2+-CaM (favorisce l’allineamento spaziale dei due domini catalitici fondamentale per il flusso elettronico)

NOS I (n) NOS II (i) NOS III (e) Classificazione e distribuzione tissutale delle NO sintasi NOS I (n) NOS II (i) NOS III (e) Neuroni (SNC e SNP) Astrociti Muscolo scheletrico Isole pancreatiche Epitelio gastrico e polmonare Rene Costitutiva Genera conc nM di NO Monociti-macrofagi Può essere indotta da citochine e prodotti di derivazione batterica in: cellule immunocompetenti, endotelio, muscolo liscio e cardiaco, cheratinociti, epatociti, mastociti, adipociti, etc. Inducibile (INF,TNFα,ILs) Genera conc μM di NO Endotelio Sistema nervoso Epitelio renale Miociti cardiaci Linfociti T e B Epatociti, Adipociti (~ ubiquitaria) Conc nM di NO Le NOS: - funzionano solo se associate in omodimeri - legano il complesso Ca2+/CaM NOS I e III  Ca2+-dipendenti (a basse [Ca2+]i il complesso Ca2+/CaM-E si dissocia  inattivazione della NOS) NOS II  Il legame Ca2+/CaM-E è virtualmente inscindibile anche a basse concentrazioni del catione (=> la produzione di NO è continua nel tempo e dipende dal numero di molecole di E) In assenza di Ca2+/CaM, il dominio reduttasico non è in grado di passare elettroni al dominio ossigenasico contenente il gruppo eme NB: Benchè le NOS di tipo I e III siano presenti in modo costitutivo nelle cellule, in particolari condizioni la loro espressione può essere modulata (il promotore contiene sequenze consenso per fattori di trascrizione)

Caratteristiche molecolari delle NO sintasi La regione N-terminale contiene una sequenza aa-cidica (GLGF) che interagisce con proteine di membrana contenenti domini PDZ: - PSD-95 (neuroni): posiziona l’enzima in prossimità di VOCCs e NMDA-R  imp. x la sensibilità all’ingresso di Ca2+ - a-sintrofina del sarcolemma (muscolo scheletrico): accoppia la generazione di NO (=>VD) con la contrazione Siti di fosforilazione (es x la PKC  < l’attività enzimatica) Modulazione dell’espressione da parte di fattori trascrizionali (AP-2, NF- 1, CREB, NFkB): imp nel corso dello sviluppo del SNC NOS II: Nessun sito di interazione con membrane  enzima prevalent. citosolico (nel musc scheletrico: interagisce con la prot di membrana caveolina-3) Nel promotore del gene per la NOS II: Due distinti siti di legame per I fattori tascrizionali responsivi a LPS (es. NF-kB, STAT-1 e AP-1) e INF (es. IRF-1). LPS stimola l’espressione in maniera diretta, mentre INF agisce potenziando l’effetto di LPS. Autoregolazione da parte di NO: L’NO è in grado di legarsi a I-kB (fattore inibitorio citosolico di NF-kB). Stabilizzando il complesso I-kB/NF-kB, l’NO impedisce la traslocazione di NF-kB al nucleo e la conseguente stimolazione della trascrizione del gene della NOS II e di altri geni sensibili. NB: NO è anche in grado di legarsi direttamente alle NOS regolandone l’attività in senso inibitorio

NOS III: Presenza nel terminale amminico di sequenze consenso per la MIRISTILAZIONE e per la PALMITOILAZIONE Miristilazione: favorisce l’ancoraggio dell’E alle membrane cellulari (Golgi, membr. plasmatica, mitocondri. Solo il 5-10% dell’E è libero nel citosol) Palmitoilazione: svolge una funzione accessoria alla miristilazione e favorisce l’associazione dell’E alla caveolina (inattivazione) Nelle cellule endoteliali e nei cardiomiociti la NOS III è localizzata a livello della membrana per associazione con la caveolina. L’interazione con questa proteina è regolata da: fosforilazione in tirosina: favorisce il legame con la caveolina e inibisce la generazione di NO (in condizioni basali l’E è fosforilato). La defosforilazione permette l’attivazione dell’E da parte di Ca2+-CaM ↑[Ca2+]i: favorisce la dissociazione del complesso con la caveolina => attivazione dell’E. Fosforilazione in serina da parte di Akt (PKB): abbassa la soglia di [Ca2+]i necessaria per l’attivazione dell’E. La via PI-3K/Akt è stimolata da fattori di crescita, citochine, stimoli chemotattici e “shear stress”. Fosforilazione in treonina da parte di PKA o PKC: inibizione attività enzimatica (meccanismo: ↓ attivabilità da parte di Akt). Il promotore contiene siti di legame per AP-1, AP-2, NF-1 e steroidi  > espressione NOS III in condizioni di carenza metabolica, ipossia, ischemia, esposizione al freddo ed esercizio fisico (nell’endotelio, nel muscolo cardiaco, negli epatociti e negli adipociti bruni).

Effetti cellulari dell’NO EFFETTI FISIOLOGICI (a conc nM di NO): - attivazione guanilato ciclasi citosolica - inibizione citocromo c ossidasi NITRAZIONE PROSTACICLINA SINTASI: Regolazione di risposte patologiche Inibisce l’attività dell’enzima => ↓ sintesi prostaciclina => VC indotta da agenti pro-infiammatori (es. LPS) NITROSILAZIONE DEI TIOLI: I gruppi SH del glutatione e di altri mercaptani sono rapidamente accessibili al NO e ai suoi derivati reattivi (ONOO-) => si forma nitroso glutatione (GSNO) => in condizioni normali i mercaptani impediscono la S-nitrosazione delle proteine S-NITROSAZIONE DELLE PROTEINE: Avviene quando il sistema tampone dei mercaptani si esaurisce (es. produzione eccessiva di NO durante l’infiammazione) => danno cellulare. La nitrosazione in genere inibisce la funzione di proteine: gliceraldeide 3-P DH (glicolisi) glutatione perossidasi e glutatione reduttasi creatina K fosfotirosin-fosfatasi complessi I, II e III della catena respiratoria mitocondriale DEAMMINAZIONE DNA e FORMAZIONE DI NITRO-TIROSINE: Avvengono in condizioni estreme (profonda ossidazione cellulare, presenza di alte conc di specie reattive dell’ossigeno e dell’NO) Indici di danno cellulare aspecifico e terminale

Effetti fisiologici dell’NO (nM) ⊕  Guanilato ciclasi citosolica Citocromo c ossidasi ↑ cGMP ⊕ PK-cGMP dip. (G-chinasi) L’NO funziona da “sensore” per l’O2: si lega reversibilmente alla cit-c ossidasi sullo stesso sito in cui si lega O2=> competizione Normossia: legame con O2 Ipossia: favorito il legame con NO  rallentamento della respirazione (< consumo energetico) PLCβ e  IP3-R Ingresso di Ca2+ by SMOC e VOCC ⊕ Estrusione di Ca2+ dal citosol (⊕scambiatore Na+/Ca2+ e Ca2+-ATPasi di membrana) ↓ [Ca2+]I (Feedback negativo: la produzione di NO, stimolata dall’↑ [Ca2+]i, limita a sua volta questo aumento)

Agenti vasocostrittori Ruolo della G-chinasi nella regolazione del tono vascolare da parte dell’NO Agenti vasocostrittori  >[Ca2+]i ⊕ chinasi della catena leggera della miosina contrazione muscolo liscio vascolare ⊕NOS III > NO <[Ca2+]i  ⊕PKA ⊕chinasi della catena leggera della miosina Il NO mantiene l’intero sistema circolatorio in condizioni di tonica vasodilatazione

Ruoli fisiopatologici dell’NO Regolazione della pressione arteriosa Regolazione del circolo coronarico Aterosclerosi (alterato rilascio di NO da parte delle cellule endoteliali) Shock endotossico (> rilascio di NO ad opera di IL-1β, IL-2, TNFα) Modulazione asse ipotalamo-ipofisario Modulazione della trasmissione sinaptica nel SNC (LTP) Attivazione corticale (stimoli acustici) Sistema nervoso vegetativo (fibre NANC) Risposte immunitarie cellulo-mediate (macrofagi e linfociti T) Mediatore di morte neuronale

Regolazione della pressione arteriosa: L’NO mantiene i vasi sotto un continuo tono vasodilatante (L-NMMA e L-NAME inducono VC). Inoltre l’NO media la VD indotta da acetilcolina, bradichinina e sostanza P I nitroderivati (nitroglicerina, nitroprussiato di sodio) sono potenti vasodilatatori usati in patologie cardiovascolari come l’angina pectoris, lo scompenso e le emergenze ipertensive. Regolazione del circolo coronarico: Il calibro vasale e le resistenze periferiche del distretto coronarico vengono accomodati, praticamente ad ogni ciclo cardiaco, dal rilascio di mediatori endoteliali a breve durata di azione, fra cui l’NO. Nella riperfusione dopo ischemia miocardica si generano radicali dell’ossigeno => reagendo con NO producono ONOO- => danno cellulare e consumo di NO => effetti negativi sulla regolazione del flusso Aterosclerosi: L’NO inibisce l’aggregazione piastrinica e l’adesione dei leucociti all’endotelio Ipotensione da shock endotossico: Alcune citochine (IL-1β, IL-2, TNFα) inducono la sintesi di NOS II da parte delle cellule muscolari lisce => intensa VD e ipotensione grave Emicrania: In alcune forme di emicrania, alla base della persistente VD dei vasi meningei c’è un’abnorme attivazione della via meabolica L-arginina-NO.

Modulazione delle risposte immunitarie: L’espressione della NOS nelle cellule immunocompetenti può essere stimolata da citochine, chemochine (SDF-1), infezioni batteriche o virali e attivazione di recettori di morte (CD95 o TNF-a). I prodotti di derivazione batterica (es. LPS)  la NOS attraverso i TLR La produzione di un eccesso di NO favorisce: l’azione citotossica dei macrofagi blocco delle deidrogenasi batteriche produzione di ONOO- morte per apoptosi dei macrofagi infettati ridotta disponibilità di L-arginina importante per il metabolismo di alcuni batteri la proliferazione dei linfociti T

Controllo della morte cellulare da parte dell’NO A concentrazioni fisiologiche l’NO inibisce l’apoptosi mediante meccanismi mediati dalla G-chinasi: inibizione della proteolisi degli zimogeni inattivi delle caspasi (pro-caspasi) a caspasi attive ↑ espressione del fattore anti-apoptotico Bcl2 inibizione della permeabilità mitocondriale inibizione dell’attivazione delle sfingomielinasi da parte di recettori proapoptogeni => ↓ ceramide I neuroni hanno livelli di mercaptani relativamente modesti, inoltre non sono capaci di utilizzare la via glicolitica per generare energia => in queste cellule l’NO può avere effetti tossici anche a conc basse Eccitotossicità da glutammato (es. ischemia) => ↑ NO => neurotossicità per inibizione cit-c ossidasi (↓ capacità dei neuroni di generare energia) e per formazione di perossinitrito.