Analisi molecolare del mutante csn5a in Arabidopsis thaliana FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Triennale in Scienze Biologiche Curriculum Genetico-molecolare Anno Accademico 2014-2015 Analisi molecolare del mutante csn5a in Arabidopsis thaliana Relatore interno: Prof.ssa Giovanna Serino Relatore esterno: Dott.ssa Maura Cardarelli Candidato: Francesco Santini

CRLs (Cullin-ring ligases) Hua and Vierstra, 2011 Le CRLs: Rappresentano la classe più ampia di ubiquitina ligasi, che portano alla “ubiquitinazione” dei complessi destinati alla degradazione da parte del proteasoma 26S. Sono conservate in tutti gli eucarioti. Sono costituite da diverse subunità tra cui “cullin” che viene modificata tramite aggiunta del peptide NEDD8 – neddilazione –. Ubiquitinano il substrato mediante la neddilazione, mentre la deneddilazione le inattiva.

La subunità “cullin” delle CRL è neddilata da AXR1 e deneddilata dal CSN È codificata dal gene AXR1 (cromosoma I). Sono disponibili vari mutanti puntiformi, tra cui axr1-3. Il CSN/COP9 signalosoma: È composto da 8 subunità (CSN1-8). Sono disponibili vari mutanti tra cui csn5a-1. Eckardt, 2003 Hua and Vierstra, 2011

Il mutante axr1-3 I mutanti axr1-3 mostrano un fenotipo pleiotropico caratterizzato da: Ridotta dominanza apicale. Scarsa fertilità. Ridotta risposta gravitropica. Nelle plantule le foglie della rosetta sono arricciate, con margini irregolari e piccioli più corti rispetto alle foglie wild-type. Col-0 axr1-3 Lincoln and Estelle, 1990 Dharmasiri et al., 2007

La subunità CSN5 e i mutanti csn5a è responsabile dell’attività catalitica del CSN è codificata dai geni CSN5A e CSN5B (entrambi sul cromosoma I). - CSN5A è maggiormente espresso rispetto a CSN5B. Sono disponibili due mutanti inserzionali, csn5a-1 e csn5a-2 e uno per csn5b. I mutanti csn5a-1 hanno un fenotipo più severo dei mutanti csn5a-2 e presentano: Plantule con alterazioni nella formazione dei cotiledoni. Piante adulte con un fenotipo nano e perdita di dominanza apicale e allo stadio riproduttivo fiori più piccoli. Lingaraju et al., 2014 Gusmaroli et al., 2007

Scopo dell’Elaborato Isolamento di una linea mutante F2 di Arabidopsis doppio omozigote per: csn5a-1 (-/-) e axr1-3 (-/-) a partire dalla linea F1 ottenuta dall’incrocio dei due singoli mutanti csn5a-1 (-/-) e axr1-3 (-/-) csn5a-2 (-/-) e axr1-3 (-/-) a partire dalla linea F1 ottenuta dall’incrocio dei due singoli mutanti csn5a-2 (-/-) e axr1-3 (-/-) Marzi 2014, dati non pubblicati

Analisi molecolare: PCR genomiche F1 (T-DNA)

Analisi molecolare: PCR genomiche F1 (T-DNA) Generazione F1 ―――――――― A B C + Col-0 – 1 kb – CSN5A-1 RP ――――― LBb1.3

Analisi molecolare: PCR genomiche F1 (T-DNA) Generazione F1 ―――――――― A B C + Col-0 – Generazione F1 ――――――― 1 2 + Col-0 – 1 kb – 1 kb – CSN5A-1 RP ――――― LBb1.3 CSN5A-2 RP ――――― LBb1.3

Analisi molecolare: PCR genomiche F2 (Endogeno)

Analisi molecolare: PCR genomiche F2 (Endogeno)

Analisi molecolare: PCR genomiche F2 (T-DNA)

Analisi molecolare: PCR genomiche F2 (T-DNA)

Analisi molecolare: PCR genomiche F2 (T-DNA)

Analisi molecolare: PCR genomiche F2 (Actina/Endogeno) Generazione F2 ―――――――――――――――――――――――――― 1 10 13 14 16 19 21 33 Col-0 – 500 bp – ACT2 ROB FOR ――――― ACT2 ROB REV Generazione F2 ―――――――――――――――――――――――――― 1 10 13 14 16 19 21 33 Col-0 – 1 kb – CSN5A-1 RP ――――― CSN5A-1 LP

Conclusioni e Prospettive future Ho isolato 3 linee mutanti omozigoti csn5a-1 (-/-). Ho determinato la putativa eterozigosi per le altre 33 linee csn5a-1 (occorrerà eseguire uno screening per il T-DNA). Le 3 linee mutanti omozigoti csn5a-1 (-/-) verranno analizzate per la presenza della mutazione puntiforme axr1-3, è attualmente in corso la messa a punto della reazione di digestione enzimatica.

Digestione Enzimatica 2 11 12 + Col-0 Col-0 250 bp – Wt 2 axr1-3