Tecniche genetico molecolari per la produzione di ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae deleti in geni non essenziali e studio di mutanti Temperatura Sensibili Laurea triennale in Scienze Biologiche Candidato Silvia Gasparini Relatore Dott.ssa Patrizia Filetici A/A 2014/2015

Il lievito Saccharomyces cerevisiae Genetica inversa Sistema modello d’eccellenza Sequenza genomica nota Facile manipolazione in laboratorio Gene disruption Cassette geniche Trasformazione per ricombinazione omologa Elevata conservazione evolutiva dei meccanismi cellulari fondamentali Studio funzione geni non essenziali Pagina 2 Pagina 1

Cse4: variante dell’istone centromerico H3 Incorporata in unico ottamero istonico nella regione centromerica CDEII Essenziale per successiva formazione cinetocore e corretta segregazione cromosomica Ubiquitinazione Catene di poliubiquitina Degradazione proteasomica Elimina copie presenti in siti ectopici Pagina 2 Pagina 2

istone variante centromerica H3 Studio delle interazioni genetiche e funzionali Analisi fenotipica di ceppi deleti in geni non essenziali Cse4 istone variante centromerica H3 Psh1 E3 ubiquitina ligasi Ubp8 ubiquitina proteasi Doa1 ubiquitina ligasi Pathway coinvolto nella regolazione della localizzazione centromerica di Cse4 Pagina 2 Pagina 3

Background genetico dei ceppi w303 wild type 28°C cse4-1 temperatura sensibile CSE4: gene essenziale 35°C cse4-1, Dpsh1 cse4-1, Dubp8 PSH1, UBP8, DOA1: geni non essenziali cse4-1, Ddoa1 cse4-1, Dpsh1/Dubp8 Disruption genica cse4-1, Ddoa1/Dpsh1 cse4-1, Ddoa1/Dubp8 Pagina 2 Pagina 4

Disruption dei geni PSH1 e UBP8 nel doppio mutante cse4-1,Ddoa1 Amplificazione della cassetta di trasformazione HIS-3 cse4-1, Ddoa1/Dpsh1 cse4-1, Ddoa1/Dubp8 Analisi cassetta HIS-3 contenente sequenze di omologia per PSH1 Pagina 2 Pagina 5

Identificazione dei ceppi trasformati Selezione di colonie istidina + Colony PCR ~ 350 bp ~ 350 bp PSH1 HIS-3 K2 UBP8 HIS-3 K2 Pagina 2 Pagina 6

Identificazione di interazioni geniche tra proteine mediante l’analisi di ceppi mutanti Confronto tra singoli e doppi mutanti Effetto migliorativo o peggiorativo Pagina 7

Effetto migliorativo Effetto peggiorativo Recupero della crescita Letalità sintetica x b a Interazione funzionale a b x Interazione epistatica Pagina 8

Saggio di crescita su piastra Osservazione delle interazioni geniche e funzionali Pagina 2 Pagina 9

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CONCLUSIONI Doa1 Psh1 Ubp8 Cse4 +Ub -Ub S. cerevisiae organismo modello Genetica reversa Ceppi t.s. cse4-1 Interazioni geniche e funzionali Interazione funzionale di DOA1 e PSH1 con CSE4 Letalità sintetica Interazione epistatica tra PSH1 e UBP8 con CSE4 Recupero della crescita Esclusiva localizzazione centromerica della variante istonica Cse4 tramite proteolisi mediata da ubiquitina Pagina 2 Pagina 11

GRAZIE PER L’ATTENZIONE Pagina 2