Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA

RICONOSCONO I PROMOTORI? LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

DEL PROMOTORE PROSSIMALE FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE

Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

Promotori ~200 bp gene

ATTIVITA’ 100% 100% 20% 1% 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ 100% Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

attivato basale Livello di trascrizione represso

Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region

6 bp elemento ricco in purine RNAP II Inr DPE BRE TATA ~24bp TATA-box 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA 2-3 subunits 12 subunits TFIIE TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA TFIID 2-3 subunits 12 subunits 10 subunits TFIIB TFIIH 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits

RNAP II Inr DPE TATA-box 8 bp AT lega TFIID BRE 6 bp lega TFIIB Inr

TFIID TFIIF RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH

TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors —TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

TFIID ~24bp TATA BRE Inr DPE

TFIIA TFIID TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA TATA BRE Inr DPE TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

TFIIB TFIID TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

TFIIF TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

TFIIE TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

TFIIH TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II TFIIH ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

— REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

Regolatori gene specifici • hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

(MADS box)

H O C N H Donatore Accettore

A D A M A A D M A D A D A A A A A D A A A A D A

Regolatori gene specifici Contengono un dominio che lega il DNA E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region

Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi? DNA loop

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

Controllo combinatoriale dell’espressione genica

Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

Enhancer e Repressori RNAP promotore enhancer gene 10-50,000 bp repressore enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer

Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche Cambio dell’attivita’ Cambio della localizzazione cellulare

Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali TBP TAF RNA pol II RGRACANNNTGTYCY

Nuclear Receptors Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 GR GR GR TATA GR hsp90 GR GR Dissociazione da hsp90 GR hsp90 dimerizzazione Migrazione nel nucleo Legame al DNA

Regolazione mediante fosforilazione Ormoni attivano una chinasi La chinasi fosforila un fattore di trascrizione Il fattore e’ attivato

Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK P MEKK SEK SEK P MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase JNK P JNK P SEK fosforila JNK – una MAP kinase

Cascata delle chinasi nucleo TRE JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali nucleo RNA pol II JNK P C-JUN P C-FOS P C-JUN TRE

Metilazione del DNA La citosina puo’ essere metilata: Risulta in una maggiore condensazione della cromatina La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X

Trascrizione e struttura della cromatina Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

Acetilazione degli Istoni E’ una modificazione post-traduzionale Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive Eliminano le interazioni ioniche con il DNA Diminuiscono la condensazione Associati con una attiva trascrizione

Acetilazione/Deacetilazione

Attivatori: acetilazione degli Istoni Alcuni attivatori attirano delle acetilasi Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

Alcune Istone Acetilasi (HAT) p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

Repressori: deacetilazione degli Istoni Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

Acetilazione/Deacetilazione

SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

Macchinari di Rimodellamento Tutti contengono subunita’ simili a swi-2/snf NTP-binding proteins

Regolazione dell’Espressione Genica Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: NUCLEUS CYTOSOL inactive mRNA degradazione DNA RNA transcript mRNA mRNA trascrizione Maturazione trasporto traduzione protein controllo dell’attivita’ inactive protein

Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici Scan Hartwell Fig 8.18

L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA Figure 11-39

La deaminasi e’ presente mRNA editing Nel fegato Deamination of a C to a U creates a stop codon resulting in a truncated form of Apo B in the small intestine rather than the long form found in liver La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nell’intestino

Metodi per studiare l’espressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

Purificazione dell’RNA Procedura Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi Rimozione delle proteine Precipitazione specifica dell’RNA

Northern blot Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA Studi sull’espressione genica

Northern blot Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare Trasferimento dell’RNA su una membrana Ibridazione con una sonda marcata

+ - tampone elettroforetico 100V 0,2A + - generatore di corrente gel di agarosio scatola elettroforetica tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

Separa le molecole in base alla dimensione Gel Elettroforesi- Separa le molecole in base alla dimensione

Trasferimento su supporto solido

Trasferimento dal gel alla membrana

Dopo il trasferimento gel membrana

Preparare la sonda per il Northern Blot

Ibridazione La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

Lavaggio Rimozione della sonda non legata al supporto solido

Rivelazione degli ibridi Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

Northern blot La rivelazione avviene usando: DNA marcato con radioattivo(32P) DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

Northern blot Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

Svantaggi del Northern Blot Richiede grandi quantita’ di RNA E’ un processo lungo e laborioso

Ibridazione dell’RNA in situ Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T7/T3 or SP6 promoter

RNA in situ hybridization Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’

Il saggio di “run-on” (o della catena nascente di RNA) permette di determinare il livello di trascrizione di un gene Purificare i nuclei + NTP, 32P GTP Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva Estrazione dell’RNA Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici analizzata tramite run-on Lodish Figure 10-23

Northern blotting RNA isolation Probe labeling Gel electophoresis AAAAAA Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography Northern blotting allows easy and more or less quantitative detection of a limited number of transcripts. Total RNA (or mRNA) is separated on an agarose gel and transferred to a nylon membrane. This membrane is then incubated with a radiolabeled probe derived from the gene of interest. After hybridization, size and amount of the corresponding transcript in the RNA pool are revealed by autoradiography. The method is not very sensitive.

reverse Northern blotting Reverse Northern blotting is the opposite of Northern blotting. Here, specific probes are immobilized on a nylon membrane and subsequently hybridized to radiolabeled cDNA derived a pool of mRNA. Multiple identical membranes can be hybridized with different cDNA pools, and the relative intensity of the hybridization signal for each spot will reveal the extent of regulation of the corresponding transcripts. This method depends has evolved into the modern cDNA macro and micro array techniques.