Composti estranei all’organismo XENOBIOTICI Composti estranei all’organismo Contaminanti ambientali assorbiti attraverso la pelle, i polmoni o introdotti con l’alimentazione Prodotti chimici industriali (pesticidi, inquinanti) Prodotti di pirolisi della cottura dei cibi Alcaloidi (sostanze azotate prodotte nelle piante a partire da aminoacidi aromatici) metaboliti secondari delle piante Tossine prodotte da funghi, piante, animali Farmaci Gli xenobiotici sono spesso SOSTANZE LIPOFILICHE

BIOTRASFORMAZIONE degli XENOBIOTICI ASSORBIMENTO METABOLISMO E L I M N A Z O Fase I Coniugato Fase II Xenobiotico Metabolita con attività diversa Coniugato Xenobiotico XENOBIOTICI: Composti estranei all’organismo presenti come contaminanti ambientali assorbiti attraverso la pelle, i polmoni o introdotti con l’alimentazione. Farmaci, pesticidi, agenti industriali, inquinanti, prodotti di pirolisi durante la cottura dei cibi, alcaloidi (sostanze azotate prodotte nelle piante a partire da aacidi aromatici), metaboliti secondari delle piante, tossine prodotte da funghi, piante, animali. Gli xenobiotici sono spesso SOSTANZE LIPOFILE. Biotrasformazione=Metabolismo Le molecole organiche farmacologicamente attive o contaminanti ambientali (xenobiotici) tendono ad essere fortemente lipofile e restano in forma non ionizzata. Tendono perciò ad essere scarsamente eliminabile dal sistema renale. Molti farmaci agirebbero molto a lungo se non venissero metabolizzati ed escreti (es. anestetici o barbiturici (tiopentale o pentobarbital). Alcuni farmaci richiedono invece di essere metabolizzati per svolgere la loro azione (in pratica è il metabolita il principio attivo). Vengono utilizzati per la loro biotrasformazione sistemi enzimatici esistenti, che servono per il metabolismo degli acidi grassi (desaturazione), sintesi del colesterolo e degli ormoni steroidei, delle prostaglandine e leukotrieni (eicosanoidi, derivati dell’acido arachidonico, mediatori o ormoni locali che agiscono tramite recettori sono implicati nella segnalazione del dolore e dell’infiammazione). I metaboliti sono spesso meno attivi del farmaco di partenza ma possono acquisire proprietà mutagene e cancerogene (intermedi reattivi). Concetto di BIOATTIVAZIONE e legame covalente a DNA e proteine. Le biotrasformazioni si dividono in una fase I e II. La fase I porta all’introduzione o allo smascheramento di un gruppo idrofilico (-OH, -SH, -NH2) all’idrolisi, riduzione, ossidazione. La fase II alla coniugazione con un vettore fisiologico (zucchero, acido glucuronico, acido acetico, acido solforico o glutatione) che faciliti l’escrezione. Alcune volte le reazioni della fase II possono precedere quelle della fase I. Le reazioni di biotrasformazione avvengono essenzialmente a carico del fegato, ma anche polmoni, gastrointestinale, reni. Metabolita inattivo Coniugato Xenobiotico Lipofilico Idrofilico

Enzimi del metabolismo degli xenobiotici Tipi di reazioni Enzima Fase I Ossidazione Riduzione Idrolisi Fase II Coniugazione Citocromo P450 Alcol deidrogenasi Aldeide deidrogenasi Monossigenasi flaviniche Monoaminossidasi Chinone reduttasi (DT diaforasi) Citocromo P450 reduttasi Epossido idrolasi UDP glucuronil transferasi Solfotransferasi N-acetil transferasi Metiltransferasi Coniugazione con amminoacidi Glutatione transferasi Gli enzimi sono localizzati nel reticolo endoplasmatico, nel citosol, nei mitocondri, sulla membrana plasmatica.

CITOCROMO P450 (emoproteina) Il ferro dell’eme è pentacoordinato dai 4 pirroli della protoporfirina IX, da una cisteina (tiolato) la sesta posizione di coordinazione è occupata dall’H2O. Quest’ultima viene spiazzata dall’O2 e dal CO. L’eme è legato ad una cisteina conservata, che conferisce particolari caratteristiche spettroscopiche a questa emoproteina.

Cys SH Protoporfirina: anello tetrapirrolico Protoporfirina IX + Fe = Eme

quando il Ferro è nello stato ridotto (Fe2+) e legato al CO Il Cyt P450 assorbe a 450 nm quando il Ferro è nello stato ridotto (Fe2+) e legato al CO (monossido di carbonio) Il massimo di assorbanza del complesso col CO varia poco tra gli isoenzimi del P450 (447-452). Tutte le altre emoproteine che legano il CO assorbono a 420. Il valore più alto del P450 è dovuto al fatto che c’è una cisteina legata al gruppo eme. Il complesso eme-CO può essere dissociato dall’esposizione alla luce (fotodissociazione). Quando si denatura il P450 perde il picco a 450 nm e produce un picco a 420 nm.

Caratteristiche spettroscopiche del citocromo P450

Localizzazione intracellulare Il citocromo P450 degli eucarioti è ancorato alle membrane microsomiale e mitocondriale Gli enzimi P450 predisposti al metabolismo degli xenobiotici si trovano soprattutto nel reticolo endoplasmatico del fegato Il citocromo P450 microsomiale è legato alla membrana del reticolo endoplasmatico tramite la regione N-terminale idrofobica che forma un’elica transmembrana.

Reazione catalizzata dal P450 Il citocromo P450 è una ossidasi a funzione mista (monossigenasi) XH + O2 + NAD(P)H + H+ XOH + NAD(P)+ + H2O Reazione catalizzata dal P450 X = Substrato

SUBSTRATI DEL CITOCROMO P450 Xenobiotici Composti di origine fisiologica Colesterolo, Steroidi Eicosanoidi (leucotrieni, prostaglandine) Acidi grassi Idroperossidi dei lipidi Retinoidi (vitamina A) Acetone Farmaci, inclusi antibiotici Carcinogeni Antiossidanti Solventi Anestetici Coloranti Pesticidi Derivanti del petrolio Alcol Odori

Sistema di trasporto degli elettroni del citocromo P450 Uno dei problemi: il ferro-eme del gruppo prostetico può accettare un elettrone alla volta mentre l’NADPH trasferisce generalmente due elettroni Per cui è necessaria una proteina che prende due elettroni dall’NADPH e ne trasferisce uno al citocromo P450 Questa funzione è svolta da una flavoproteina NADPH-dipendente Il sistema di trasporto degli elettroni dall’ NADPH al citocromo P450 si trova associato con le membrane mitocondriali o del reticolo endoplasmatico

Sistema di trasporto microsomiale del citocromo P450 Nel reticolo endoplasmatico l’NADPH dona gli elettroni ad una flavoproteina denominata NADPH-citocromo P450 reduttasi Peso molecolare di 78 kDa Contiene sia il FAD che l’FMN come gruppi prostetici N-terminale contiene numerosi residui idrofobici ed è la parte associata alla membrana Il FAD prende elettroni dall’NADPH L’FMN li dona al ferro Gli elettroni possono derivare dal citocromo b5 Il citocromo b5 è ridotto: - NADPH-citocromo P450 red - NADH-citocromo b5 red La reduttasi è legata alla membrana tramite una coda idrofobica. Il citocromo b5 partecipa solo ad alcune reazioni speciali a cui partecipa il P450. La reduttasi contiene sia FAD che FMN: La porzione N terminale contiene numerosi amminoacidi idrofobici e sta nella membrana. Gli elettroni entrano dal FAD e escono dal FMN. L’enzima può ricevere i due elettroni dal NADPH uno per ciascuna molecola flavinica e cederli uno alla volta al ferro eminico, uno per ridurlo e permettere l’attacco dell’O2 e poi per scindere l’O2. In alcuni batteri il P450 è costituito dalla fusione della flavoproteina col P450 stesso (1 solo gene, una sola proteina multifunzionale). Ossido nitrico sintasi. La concentrazione della P450 reduttasi è minore del P450, perché gli cede elettroni molto più velocemente di quanto esso possa utilizzarli. Inoltre, poiché la P450 reduttasi può effettuare reazioni di riduzione monoelettronica attivando essa stessa substrati a prodotti ridotti nocivi, è bene che la sua concentrazione sia bassa. Il citocromo b5 può agevolare la reazione fornendo in alcuni casi esso stesso il secondo dei due elettroni al P450, ricevuti da una cit b5 reduttasi e dal NADH

Sistema di trasporto microsomiale del citocromo P450 La reduttasi è legata alla membrana tramite una coda idrofobica. Il citocromo b5 partecipa solo ad alcune reazioni speciali a cui partecipa il P450. La reduttasi contiene sia FAD che FMN: La porzione N terminale contiene numerosi AA idrofobici e sta nella membrana. Gli elettroni entrano dal FAD e escono dal FMN. L’enzima può ricevere i due elettroni dal NADPH uno per ciascuna molecola flavinica e cederli uno alla volta al ferro eminico, uno per ridurlo e permettere l’attacco dell’ O2 e poi per scindere l’ O2. In alcuni batteri il P450 è costituito dalla fusione della flavoproteina col P450 stesso (1 solo gene, una sola proteina multifunzionale). Ossido nitrico sintasi. La concentrazione della P450 reduttasi è minore del P450, perché gli cede elettroni molto più velocemente di quanto esso possa utilizzarli. Inoltre, poiché la P450 reduttasi può effettuare reazioni di riduzione monoelettronica attivando essa stessa substrati a prodotti ridotti nocivi, è bene che la sua concentrazione sia bassa. Il citocromo b5 può agevolare la reazione fornendo in alcuni casi esso stesso il secondo dei due elettroni al P450, ricevuti da una cit b5 reduttasi e dal NADH

Citocromo P450 reduttasi Cytochrome P450 Reductase (CPR) is a flavoprotein containing both FAD and FMN. It has a modular structure suggestive of its evolution from smaller subunits similar to flavodoxins and ferredoxin NADP+ reductase, and its 3-dimensional structure was recently determined. CPR is also a component of nitric oxide synthases and methionine synthase reductase. The enzyme has been proposed to cycle between the 1- and 3-electron reduced states under physiologic conditions, as shown above:

Sistema di trasporto microsomiale del citocromo P450 SOH Non si conosce la ragione dell’esistenza delle due vie

H2O2 O2. Se il ciclo catalitico viene interrotto dopo l’aggiunta del primo elettrone (*) si può avere la liberazione di superossido. Se il ciclo si interrompe dopo il secondo elettrone si libera H2O2. Si può liberare anche il radicale dello xenobiotico quando ci sono basse tensioni di O2 (ad es. in anaerobiosi). Formazione di intermedi reattivi, radicalici. Il CO è un forte inibitore perché si lega al posto dell’ossigeno. S.

Xenobiotici metabolizzati dal citocromo P450 Reazione Esempi Ossidrilazione comp. alifatici Ossidrilazione comp. aromatici Formazione di epossidi Dealchilazioni ossidative Deaminazione ossidativa Ossidazione di N o S o P Rimozione di alogeni Ossidazione di alcoli Acido valproico, pentobarbital Benzopirene, fenobarbital Benzene, benzopirene Fenacetina, morfina, caffeina Anfetamina Cloropromazina, paracetamolo Alotano Alcol etilico Riduzione (bassa [O2]) Alotano, CCl4 Epossido: aggiunta di un ossigeno ad un doppio legame tra due carboni. due atomi di carbonio legati fra loro e legati ciascuno ad un ossigeno Acido valproico = antiepilettico Pentobarbital (barbiturico) = sedativi, antidolorifici (analgesici) Debrisochina = antiipertensivo Acetanilide = Benzene = inquinante ambientale, cancerogeno, teratogeno, mutageno. Aminopirina = Fenacetina = analgesico, antipiretico, antinfiammatorio, ma ritirato. Anfetamine:stimolanti del sistema nervoso centrale Cloropromazina = sedativo, nell’eccitamento, schizofrenia. Paration Alotano CCl4 Etanolo

Ossidrilazione composti alifatici Pentobarbital

EPOSSIDAZIONE Fenobarbital (sedativo, analgesico)

cancerogeno

Reazioni di dealchilazione Dealchilazione dell’atomo di ossigeno Deacetilazione dell’atomo di azoto HCHO Ossidazioni di N, S, P e reazioni di dealogenazione. Alotano = anestetico gassoso; paratione=insetticida organofosforico;inibitore dell’acetilcolinaesterasi aminopirina= antiinfiammatorio; breath test perché si produce CO2, funzionalità epatica; Fenacetina=analgesico, antipiretico, antinfiammatorio, ma ritirato. Cloropromazina: sedativo, nell’eccitamento, schizofrenia. Come l’alotano. Deacetilazione dell’atomo di zolfo HCHO

Dealchilazione sull’atomo di azoto Morfina alcaloide ottenuto dall’oppio Caffeina (1,3,7-trimetil xantina)

REAZIONI DI OSSIDAZIONE

Dealogenazione riduttiva del CCl4 (tetracloruro di carbonio) Solvente organico Dealogenazione riduttiva da P450. fig 6-12 manzo.

CYP… SUPERFAMIGLIA Circa 150 geni Cyp 3A4 metabolizza circa il 60% dei 10-15% nel fegato 5% 30% CYP… SUPERFAMIGLIA Circa 150 geni 9 % Cyp 3A4 metabolizza circa il 60% dei farmaci Albero filogenetico. Presenti in numerose forme isoenzimatiche: proteine diverse che catalizzano la stessa reazione e originano dallo stesso gene ancestrale. I P450 costituiscono una famiglia di proteine (17 famiglie). Per duplicazione genica si hanno circa 150 geni. I P450 con meno del 40% di identità di sequenza sono riconducibili a famiglie di geni differenti (1,2,3 etc). Dal 40 al 55% sono classificati come membri di diverse sottofamiglie (2A, 2B,2C etc). Sopra il 55% fanno parte della stessa sottofamiglia (2A1,2A2, 2A3 etc). Le famiglie CYP1, CYP2 e CYP3 comprendono gli enzimi che metabolizzano gli xenobiotici. I livelli delle attività di ciascun isoenzima variano da individuo ad individuo per fattori ambientali o genetici. Il P450 3A4 da solo è responsabile del metabolismo epatico di >60% dei farmaci usati in clinica. Alcuni xenobiotici hanno la proprietà, se somministrati ripetutamente, di indurre P450, aumentando la sua velocità di formazione (trascrizionale) o riducendone quella di degradazione (post-traduzionale). Interazione con un recettore e migrazione al nucleo e attivazione del promotore del gene (TCCD, benzopirene) oppure stabilizzazione dell’mRNA o protezione dalla degradazione proteolitica (trioleandomicina). Gli isoenzimi del citocromo P450 sono stati suddivisi in famiglie e sottofamiglie, in base alla somiglianza strutturale nella sequenza aminoacidica, ed indicati con il prefisso CYP seguito da un primo numero indicante la famiglia, una lettera indicante la sottofamiglia ed un secondo numero indicante il singolo isoenzima. Negli ultimi anni sono stati identificati circa 30 CYPs alcuni dei quali svolgono un ruolo determinante nel metabolismo dei farmaci (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4, 2E1). Il citocromo P450 1A2 (CYP1A2), rappresenta circa il 10-15% degli isoenzimi del citocromo P450 a livello epatico. Sebbene per questo enzima non sia stata evidenziata l’esistenza di polimorfismo genetico, la sua attività varia notevolmente da individuo ad individuo. In particolare è stato dimostrato che l’attività del CYP1A2 è più elevata nelle donne e nei soggetti di razza nera rispetto agli uomini e ai soggetti di razza bianca. Il fumo di sigaretta e alcuni alimenti quali broccoli o cibi cotti alla brace possono indurre l’attività del CYP1A2 mentre l’enzima può essere inibito da farmaci quali la fluvoxamina, furafillina e i chinoloni (ciprofloxacina, norfloxacina, ofloxacina). Il citocromo P450 2D6 (CYP2D6) è uno dei più importanti isoenzimi coinvolti nel metabolismo ossidativo dei farmaci e sebbene sia quantitativamente uno dei meno rappresentati (< del 5% del totale nel fegato), catalizza l’ossidazione di più di 30 farmaci (antidepressivi ciclici, neurolettici, antiaritmici, beta-bloccanti ecc.). Il CYP2D6 è presente in concentrazioni minori, oltre che a livello epatico, anche nel cervello. Esso è stato ampiamente studiato non solo per l’importante ruolo svolto nel metabolismo di numerosi farmaci, ma soprattutto perché la sua attività è soggetta a polimorfismo genetico, per cui è possibile distinguere nella popolazione almeno due fenotipi: metabolizzanti lenti (PM) e metabolizzanti rapidi (EM). Il citocromo P450 2E1 (CYP2E1) costituisce circa il 9% degli isoenzimi del citocromo P450 a livello epatico. Esso rappresenta l’unica isoforma soggetta ad un potente effetto induttore da parte dell’etanolo. Il CYP2E1 metabolizza un’ampia gamma di composti con strutture differenti, in particolare molecole piccole ed idrofobiche, compresi alcuni potenziali agenti carcinogeni ed epatotossici, dei quali sembra mediare gli effetti in seguito all’attivazione metabolica. L’espressione di questo enzima è regolata da diversi xenobiotici, molti dei quali sono anche substrati, che sono quindi capaci di indurre il loro stesso metabolismo. Il citocromo P450 2C9 (CYP2C9), è l’isoenzima più rappresentato della sottofamiglia del CYP2C ed in particolare costituisce circa il 18% degli isoenzimi del CYP450 a livello epatico. Esso catalizza l’idrossilazione dell’S-enantiomero del farmaco anticoagulante Warfarina, l’inibizione di tale isoforma può pertanto portare a conseguenze clinicamente importanti. L’enzima polimorfico CYP2C19 costituisce circa il 4% degli isoenzimi del P450 a livello epatico. E’ stato evidenziato che circa il 3-5% dei caucasici e l’8-23% degli orientali è privo di tale isoenzima in seguito ad una mutazione genetica. Il CYP2C19 catalizza il metabolismo di alcuni antidepressivi e la sua attività sembra diminuire con l’invecchiamento. Per quanto riguarda invece il citocromo P450 3A4 (CYP3A4) la sottofamiglia nell’uomo è composta da almeno 4 geni ed il CYP3A4 sembra essere il più importante espresso sia nel fegato che nell’intestino. Il CYP3A4 rappresenta circa il 30% di tutti gli isoenzimi del CYP450 presenti a livello epatico ed essendo caratterizzati da un’ampia specificità di substrato, contribuiscono al metabolismo di circa il 50% dei farmaci utilizzati. Numerosi composti sono stati identificati come substrati del CYP3A4 tra cui antidepressivi triciclici, calcio-antagonisti, antibiotici (eritromicina, claritromicina, dapsone) ecc. Farmaci quali antifungini azolici, antibiotici macrolidi e la cimetidina sono potenti inibitori di questa isoforma. Inoltre è interessante ricordare che anche alcuni flavonoidi naturali presenti nel succo di pompelmo (narigenina, quercitina) sono in grado di inibire il CYP3A4 e possono quindi determinare significative interazioni. Si deve infine ricordare che il CYP3A4 è l’enzima maggiormente rappresentato a livello del tratto gastrointestinale, dove può essere responsabile del metabolismo di molti farmaci.

“polimorfismo per la debrisochina” Farmacogenetica: basi ereditarie delle differenze tra gli individui nell’azione dei farmaci Fenotipi del CYP2D6 “polimorfismo per la debrisochina” Metabolizzatori Lenti (PM): incapacità di utilizzare la via del CYP2D6 Metabolizzatori Intermedi (IM): capacità fortemente diminuita Metabolizzatori Normali (EM): capacità normale Metabolizzatori Ultrarapidi (UM): capacità eccessiva Concetto di farmacogenetica: basi ereditarie delle differenze tra gli individui nell’azione dei farmaci. 100 mg dati ad un metabolizzatore lento possono dare pesanti effetti collaterali. Si raggiungono concentrazioni plasmatiche 2-5 volte superiori. Il fenotipo viene stabilito dopo somministrazione di un probe appropriato seguita dalla misurazione del framco e del metabolita del farmaco nel siero o nelle urine.

Polimorfismo del CYP2D6 nella popolazione caucasica Attività Schema della relazione genotipo-fenotipo di CYP2D6 e loro conseguenze farmacocinetiche e cliniche. PM = poor metabolizer, non usa 2D6; UM = ultrarapid metabolizer, alleli con più copie del gene; IM=intermediate metabolizer, sono fortemente carenti; EM=extensive metabolizer, sono normali. Quadrato vuoto=mutante nullo; quadrati neri= alleli funzionanti; quadrati zebrati= alleli con scarsa funzionalità. Le percentuali di frequenza si riferiscono ai caucasici (popolazione bianca). A destra sono indicate le concentrazioni plasmatiche del farmaco con la finestra terapeutica. E’ stato visto che i PM hanno un’incidenza bassa di malattie neoplastiche che sono inducibili per via chimica (polmone, vescica, ) Allleli nulli non codificano una proteina funzionale. UM posso avere multiple copie Co-somministrazione di un farmaco con inibitori competitivi di Cyp2D6 presenti nel cibo o anche altri farmaci Inibitori possono far cambiare il fenotipo da EM a IM o perfino PM. Allele con funzionalità normale Allele con funzionalità scarsa Mutante nullo

Polimorfismo del CYP2D6 nella popolazione caucasica Concentrazione nel siero Schema della relazione genotipo-fenotipo di CYP2D6 e loro conseguenze farmacocinetiche e cliniche. PM = poor metabolizer, non usa 2D6; UM = ultrarapid metabolizer, alleli con più copie del gene; IM=intermediate metabolizer, sono fortemente carenti; EM=extensive metabolizer, sono normali. Quadrato vuoto=mutante nullo; quadrati neri= alleli funzionanti; quadrati zebrati= alleli con scarsa funzionalità. Le percentuali di frequenza si riferiscono ai caucasici (popolazione bianca). A destra sono indicate le concentrazioni plasmatiche del farmaco con la finestra terapeutica. E’ stato visto che i PM hanno un’incidenza bassa di malattie neoplastiche che sono inducibili per via chimica (polmone, vescica, ) Allleli nulli non codificano una proteina funzionale. UM posso avere multiple copie Co-somministrazione di un farmaco con inibitori competitivi di Cyp2D6 presenti nel cibo o anche altri farmaci Inibitori possono far cambiare il fenotipo da EM a IM o perfino PM. Allele con funzionalità normale Allele con funzionalità scarsa Mutante nullo

Induttori del P450: appartengono a 5 classi, con diverso meccanismo d’azione 3-metilcolantrene, benzopirene, diossina, fumo, alimenti cotti a carbone, crocifere Fenobarbital, DTT Isoniazide, etanolo Steroidi, antibiotici Clofibrato, plastificanti CYP1A1, CYP1A2 CYP2B1, CYP2B2 CYP2E1 Gli induttori appartengono a 5 classi di composti, che operano con meccanismi diversi. Iperplasia e ipertrofia del fegato con proliferazione del reticolo endoplasmatico. I fattori ambientali che sono riconosciuti indurre il P450 sono: 1) Medicamenti (barbiturici, rifampicina, isoniazide; 2) alimenti (crocifere, carne alla griglia); 3) abitudini sociali (alcol, fumo). E’ possibile che più isoenzimi intervengano nel metabolismo di uno stesso farmaco. Isoniazide = usato nel trattamento della tubercolosi Trioleandromicina = Clofibrato = DTT = insettcida Clofibrato = ipolipidemizzante, proliferazione dei perossisomi CYP3A1, CYP3A2 CYP4A1, CYP 4A2, CYP4A3

Modalità di regolazione dell’espressione dei citocromi P450 La regolazione più diffusa avviene a livello trascrizionale. Recettore citosolico degli idrocarburi aromatici, incontro con lo xenobiotico, traslocazione al nucleo, promotore del gene.

IDENTIFICAZIONE DELLA REGIONE REGOLATRICE DEL GENE DI UN P450 Per dimostrare che la diossina induce un particolare P450. Interazione della tetracloro dibenzo diossina (TCDD) con il suo recettore citosolico (recettore degli idrocarburi aromatici Ah). Come pure benzopirene e 3 metilcolantrene. Il complesso recettore-xenobiotico viene fosforilato dalla tirosin chinasi. Si lega quindi ad un fattore di traslocazione nucleare e quindi a sequenze specifiche di alcuni geni (P450, ma anche trasferasi, DT diaforasi, aldeide deidrogenasi). I complessi si legano alla regione regolatrice del gene del P450.Trasfezione e vettori di espressione. Un frammento (hind-hind) del promotore viene inserito in un vettore di espressione a monte del gene per la cat batterica e non eucatiotica. Il plasmide viene inserito in cellule di epatoma di topo trattate con TCDD che quindi esprimeranno la CAT. Vale anche per il benzopirene. Tagliato con enzimi di restrizione a livello dei siti Hind III , inserito nel vettore pSVO CAT. AMP= gene della resistenza all’ampicillina. Exp degli anni ’80.

INIBITORI DEL CITOCROMO P450 Inibitori competitivi SKF 525 A sostanze contenenti imidazolo Substrati suicidi trioleandomicina (antibiotico macrolide) cloramfenicolo Si trasforma in un prodotto che si lega al ferro che alchila la proteina e la inattiva E’ importante nella competizione tra farmaci. Triolenadomicina è un antibiotico del gruppo dei macrolidi, il suo metabolita si lega al ferro-eme e lo rende inattivo. Il cloramfenicolo viene trasformato in un prodotto che alchila la proteina e la rende inattiva

Piante di patata transgeniche per CYP1A1(dai mammiferi) In higher plants, cytochrome P450 monooxygenase (P450) is known to conduct secondary metabolism. It also plays an important role in the oxidative metabolism of xenobiotics in cooperation with NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase (reductase). Resistance to some herbicides has been reported as a result of the metabolism by P450 as well as glutathione S-transferase. Although most of the P450s conferring herbicide resistance have not been studied well, a number of microsomal P450 species involved in xenobiotic metabolism in mammals have been characterized by molecular cloning. Some of them were reported to metabolize several herbicides efficiently. Thus, transgenic plants with mammalian P450 have been expected to show resistance to several herbicides. Mammalian P4501A1 and 2B6 were introduced to a potato cultivar, May Queen, and a rice cultivar, Nipponbare, with the Agrobacterium mediated transformation method. After selection with kanamycin and detection of the introduced gene, mRNAs and enzyme proteins of the P450 in the plant, the transformed potatoes were potted for spraying herbicide and rice R1 seeds were sowed on the culture medium containing herbicides. The potato with P4501A1 was still green and viable after being sprayed with the herbicides chlorotoluron, diuron, atrazine (inhibiting photosynthetic electron transport) and pyriminobac-methyl (blocking branched-chain amino acid biosynthesis), while the untransformed May Queen died (Fig. 1). The rice with P4501A1 germinated and grew well on the culture medium containing the herbicides diuron and pyriminobac-methyl. P4502B6 potato showed resistance to acetochlor (inhibiting protein synthesis) and metolachlor (inhibiting cell division) and P4502B6 rice showed resistance to alachlor (inhibiting protein synthesis), metolachlor and triflurarin (inhibiting cell division)(Fig. 1). Piante di patata transgeniche per CYP1A1(dai mammiferi) diventano resistenti all’erbicida clorotorulon (CT)

Enzimi del metabolismo degli xenobiotici Tipi di reazioni Enzima Fase I Ossidazione Riduzione Idrolisi Fase II Coniugazione Citocromo P450 Alcol deidrogenasi Aldeide deidrogenasi Monossigenasi flaviniche Monoaminossidasi Chinone reduttasi (NQO1 o DT diaforasi) Citocromo P450 reduttasi Epossido idrolasi UDP glucuronil transferasi Solfotransferasi N-acetil transferasi Metiltransferasi Coniugazione con amminoacidi Glutatione transferasi Gli enzimi sono localizzati nel reticolo endoplasmatico, citoplasma, mitocondri, membrana plasmatica.

Metabolismo dell’etanolo tossica Molti prodotti idrossilati da P450 diventano quindi substrati dell’ADH. Alcol deidrogenasi ed aldeide ossidasi agiscono in sequenza. Le aldeidi e gli acidi carbossilici prodotti sono tossici. Le aldeidi sono elettrofiliche, reagiscono con tioli e amminogruppi, pertanto sono mutagene, cancerogene, citotossiche.La trasformazione in acido acetico trasforma l’etanolo in una sostanza da cui si può trarre energia. Alcol deidrogenasi. Nel fegato e nello stomaco, citosolica, NAD+, metabolismo dell’etanolo. Può metabolizzare anche il metanolo. L’alool allilico viene trasformato in acroleina. Le aldeidi formate sono tutte epatotossiche. L’acetaldeide che si forma è degradata dall’aldeide dh. Il metanolo viene trasformato in acido formico, tossico. L’intossicazione da metanolo viene curata somministrando etanolo. energia Alcol deidrogenasi Aldeide deidrogenasi

Alcol deidrogenasi: enzima dimerico, citosolico, contenente Zn 5 geni (α, β, γ, π, κ). β ha 3 alleli, γ 2 alleli Quindi 8 subunità diverse che si combinano a formare isoenzimi con diversa efficienza catalitica. La subunità β è molto attiva. Gli isoenzimi presenti nelle popolazioni asiatiche sono molto efficienti. L’alcol deidrogenasi è un enzima contenente zinco. Utilizza NADH. Citosolico soprattutto epatico. E’ un dimero formato da due subunità di 40 kDa. E’ codificata da cinque geni (alfa, beta e gamma, pi e chi) e beta ha tre alleli. Pertanto possono esistere otto diverse subunità che si possono combinare diversamente a formare isoenzimi. Alfa,3 varianti alleliche di beta( beta1,beta2, beta3), 2 di gamma (gamma1 e gamma 2), pi greco e chi. Possono essere omodimeri o eterodimeri. L’omodimero beta2-beta2 e gli eterodimeri contenenti almeno una subunità beta2 sono molto efficienti. Sono molto presenti nelle popolazioni asiatiche (cinesi e giapponesi) che convertono velocemente etanolo ad acetaldeide. L’attività della ADH gastrica diminuisce nel digiuno, ecco perche l’alcol fa più effetto a stomaco vuoto. Nelle donne l’ADH gastrica è molto più bassa. Horse liver alcohol dehydrogenase exists as a homodimer or heterodimer- there are two different types of monomer, denoted E and S. However these two forms are near-identical (both consisting of 374 amino acids), as there are only six residues which are different. None of Horse liver alcohol dehydrogenase exists as a homodimer or heterodimer- there are two different types of monomer, denoted E and S. However these two forms are near-identical (both consisting of 374 amino acids), as there are only six residues which are different. None of these six occur in the interface region between the two. There are three possible combinations of the subunits: EE, SS and ES; these are therefore isozymes (or isoenzymes). When isolated from liver, 40-60% of the enzyme is of the EE form. Each of the two subunits of the horse enzyme has one binding site for NAD+ and two binding sites for Zn2+. Only one of the zinc ions is involved directly in catalysis. It is ligated by the side chains of Cys 46, His 67, Cys 174 and a water molecule which hydrogen bonds to Ser 48. (If you wish to view this water molecule, download the 8adh PDB structure, which is a monomer without NAD+, as the 6adh dimer includes no water molecules.) The zinc ion is situated at the junction of two binding sites: one of these is a pocket which binds NAD+, while the other is a cleft which binds the substrate (which is one of a variety of aromatic and aliphatic alcohols). The picture below shows the active site of the enzyme alcohol dehydrogenase with the coenzyme NADH and the inhibitor DMSO bound to the zinc containing active site Alcohol dehydrogenase is our primary defense against alcohol, a toxic molecule that compromises the function of our nervous system. The high levels of alcohol dehydrogenase in our liver and stomach detoxify about one stiff drink each hour. The alcohol is converted to acetaldehyde, an even more toxic molecule, which is then quickly converted into acetate and other molecules that are easily utilized by our cells. Thus, a potentially dangerous molecule is converted, through alcohol dehydrogenase, into a mere foodstuff. Our bodies create at least nine different forms of alcohol dehydrogenase, each with slightly different properties. Most of these are found primarily in the liver, including the beta3 form (PDB entry 1htb) and the similar enzyme from horse liver (PDB entry 6adh). The sigma form, available in PDB entry 1agn, is found in the lining of the stomach. Each enzyme is composed of two subunits, and quite remarkably, you can mix and match subunits between these different forms, creating mixed dimers that are still active. Ethanol is not the only target of these enzymes, they also make important modifications to retinol, steroids, and fatty acids. The range of different types of alcohol dehydrogenase ensures that there will always be one that is perfect for the current task.

Aldeide deidrogenasi (16 geni, famiglia di proteine): ALDH. Aldeide deidrogenasi:ossida le aldeidi ad acidi carbossilici utilizzando NAD+, è sia citosolica che mitocondriale. E’ regolata dal recettore Ah. ALDH2 found in the Asian population, called ALDH2*2.  Esistono 16 geni per ALDH su cromosomi diversi. E’ una famiglia di proteine. Nella famiglia 2, polimorfismo genico (mitocondriale) è caratterizzato da basso metabolismo delle aldeidi, ed aumentato rischio di cancro indotto da alcool. L’allele ALDH di classe 2 nelle popolazioni orientali, le stesse che hanno la variante ad alta attività della ADH, produce una proteina inattiva. Pertanto questi accumulano grosse quantità di acetaldeide in seguito a consumo di alcool, manifestando intolleranza all’alcool (vasodilatazione, flushing syndrome).Questo allele è un fattore di rischio per il cancro da alcol Aldeide deidrogenasi (16 geni, famiglia di proteine): Allele di classe 2: basso metabolismo delle aldeide, fattore di rischio per il cancro indotto da alcol Nelle popolazioni orientali: intolleranza all’alcol (vasodilatazione, “flushing syndrome”).

FMO (MONOSSIGENASI FLAVINICHE) : Ossidazione a livello di eteroatomi nucleofili: S, P, N Le monossigenasi flaviniche sono delle monossigenasi che ossidano molti xenobiotici a livello di eteroatoimi nucleofili come S, P, N. Richiedono FMN e NADPH e ossigeno. Sono presenti sul reticolo endoplasmatico.

FMO: MONOSSIGENASI FLAVINICHE DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO Monossigenasi flaviniche Fig 6-30 del manzo. Dopo che il FAD è stato ridotto dal NADPH, il NADP resta legato all’enzima ed il FAD si riduce. Si combina poi con l’O2 e forma la idroperossiflavina. Cede poi un O allo xenobiotico e diventa idrossiflavina. Si ha poi la disidratazione del FAD ed il rilascio del NADP. Il legame del NADP è importante perché previene il rilascio di perossido dall’intermedio.

Monoamminossidasi (MAO A e B) (flavoproteina mitocondriale) Trasformazione di una ammina in una aldeide (substrati fisiologici: serotonina, adrenalina, noradrenalina) RCH2NH2 + FAD RCH=NH + FADH2 RCH=NH + H2O RCHO + NH3 FADH2 + O2 FAD + H2O2 Un substrato fisiologico è la serotonina,e le catecolammine dopamina, noradrealina. E’ una flavoproteina mitocondriale presente nel fegato, ma anche nel tessuto nervoso. Esistono due forme di MAO A e B. Trasformazione del substrato in un’aldeide. E’ un’ossidasi ad acqua ossigenata .L’ossigernoi che viene incorporato nel substrato proviene dall’acqua mentre i due elettroni sottratti al substrato vengono ceduti all’ossigeno. L’atomo di ossigeno incorporato nel substrato proviene dall’ H2O, ed i 2 elettroni sottratti al substrato vengono ceduti all’O2 formando H2O2

Reazione catalizzata dalla monoamminossidasi (MAO): 1-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetraidropiridina (MPTP) Composto neurotossico che causa i sintomi caratteristici della malattia di Parkinson. Intossicazioni da droga negli anni 80 in seguito a sintesi casuale di questa sostanza. Distrugge selettivamente i neuroni dopaminergici della substantia nigra del cervello. L’MPP+ altera la respirazione mitocondriale a livello del complesso I. Il paraquat erbicida è un fattore che può dare il Parkinson.

DT-diaforasi o NAD(P)H:chinone ossidoreduttasi 1 (NQO1) Enzima citosolico Omodimero (27 kDa per subunità) Flavoproteina (FAD) Catalizza la riduzione bielettronica di substrati di natura chinonica, in un singolo passaggio Spesso i suoi livelli sono più alti nelle cellule tumorali (resistenza ai farmaci antitumorali) E’ una flavoproteina citosolica. DT-diaforasi è un omodimero formato da due subunità (27 kDa) ognuna delle quali contiene FAD. Funziona con un meccanismo tipo ping pong dove NADPH si lega, riduce FAD, lascia il sito attivo prima che si leghi il chinone substrato. I livelli di DT diaforasi sono spesso più elevati nelle cellule tumorali e questo rappresenta un problema perché esse diventano resistenti ad alcuni farmaci antitumorali (fenomeno della resistenza ai farmaci). D’altra parte siccome molti idrochinoni possono essere agenti antitumorali, questo enzima va indotto. Inibitore classico è il dicumarolo.

Xenobiotici di natura chinonica possono essere ridotti con un elettrone dalla P450 reduttasi. Formazione del semichinone etc. stress ossidativo. Possono però essere anche ridotti da due elettroni in un solo passaggio grazie alla NADPH chinone ossidoreduttasi o DT-diaforasi. Si ricordi che non tutti gli idrochinoni sono innocui, pertanto tale processo può generare un metabolita molto tossico (possono legarsi al DNA). Viene perciò considerato un enzima molto impotrtante nella chemioterapia antitumorale

Farmaci antitumorali che vengono attivati dalla NQO1 Farmaci antitumorali che vengono resi attivi dalla NQO1

Prodotti di degradazione dei lipidi perossidati

Ossidazione delle proteine: carbonilazione di residui amminoacidici Semialdeide glutamica N COR2 CONHR1 O NH -prolil- NH2 NH CONHR1 R2CONH -arginil- NH2 R2CONH -lisil- O CONHR1 NH COR2 Semialdeide aminoadipica CONHR2