GENI DI IDENTITA’ MERISTEMATICA

INDUZIONE FIORALE FIORE: complesso apparato di strutture funzionalmente specializzate e radicalmente diverse dall’organismo vegetativo sia nella forma che nei tipi cellulari La transizione verso la fioritura implica cambiamenti radicali nel destino delle cellule dei meristemi apicali Alterazione del destino delle cellule meristematiche: cambiamento di fase L’insieme degli eventi che portano l’apice del germoglio a produrre fiori si indica come INDUZIONE FIORALE

In Arabidopsis a seguito della INDUZIONE FIORALE Il meristema vegetativo passa dalla produzione ai suoi lati di foglie e primordi ascellari alla produzione di un numero indeterminato di PRIMORDI FIORALI Questo MERISTEMA APICALE si chiama MERISTEMA DELL’INFIORESCENZA Il MERISTEMA FIORALE si differenzia da un gruppo di cellule che si trovano ai lati del meristema dell’infiorescenza Il programma di sviluppo è diverso in quanto il meristema dell’infiorescenza è a crescita indeterminata mentre quello fiorale è a crescita DETERMINATA

SAM è convertito in meristema dell’infiorescenza in risposta ad uno stimolo fiorale Il meristema dell’infiorescenza è uno stato transitorio dalla crescita vegetiva a quella riproduttiva Il meristema dell’infiorescenza genera il MERISTEMA FIORALE

MI SAM

MERISTEMA DELL’ INFIORESCENZA E MERISTEMA FIORALE I primordi fiorali si originano nella stessa posizione nella quale si formano i primordi fogliari durante la crescita vegetativa; la fillotassi non è alterata

SAM indeterminato Organogenesi AM inattivo MI apicale e ascellari attivi e indeterminati MF prodotti ai lati dei MI : formazione del fiore

Le infiorescenze possono essere determinate o indeterminate is ic ds cima spiga a racemo Infiorescenza di arabidopsis (indefinita) Le infiorescenze possono essere determinate o indeterminate (semplici e composte)

Infiorescenza indefinita Infiorescenza definita

microscopio confocale

GENI DI IDENTITA’ MERISTEMATICA (FMI) La transizione è promossa da una classe di geni noti come GENI DI IDENTITA’ MERISTEMATICA (FMI) In Arabidopsis LEAFY (LFY) APETALA1 (AP1) CAULIFLOWER (CAL) MADS box FRUITFULL (FUL) TERMINAL FLOWER1 (TFL1) AGAMOUS (AG) APETALA 2 (AP2) sono anche geni omeotici

MADS: MCM1(lievito), AGAMOUS (arabidopsis), DEFICIENS (anthirrinum), SRF (uomo) In Arabidopsis oltre 100 geni MADS BOX Animali o funghi ne possiedono un numero molto minore (Drosophila 2) Nelle piante molti coinvolti nello sviluppo del fiore APETALA1, APETALA3, PISTILLATA, AGAMOUS, SEPALLATA1, SEPALLATA2, SEPALLATA3 5 classi:Ma, Mb, Mg, Md e MIKC

GENI MADS box in specie diverse Anthirrinum petunia arabidopsis pomodoro

MADS-box In rosso

induzione ABC FMI

FMI Identificati dalla scoperta di mutanti loss of function in cui i fiori sono rimpiazzati da strutture intermedie tra germoglio vegetativo e fiorale

MUTAZIONI lfy, ap1, cal compromettono la capacità del meristema vegetativo di svilupparsi in meristema fiorale

Mutante lfy: foglie al posto degli organi fiorali, con disposizione spiralata

ap1 lfy ap1 ap1: fiori secondari all’ascella degli organi del I verticillo; fiori con conversione omeotica sepali in foglie e perdita dei sepali lfy ap1 transizione fiorale bloccata ; meristemi del’infiorescenza

In Anthirrinum FLORICAULA (FLO) SQUAMOSA (SQUA) LEAFY AP1

LEAFY (LFY) La sua espressione precede la transizione fiorale ed è massima nei giovani meristemi fiorali Mutanti lfy sviluppano foglie e germogli invece di fiori LFY è necessario e SUFFICIENTE per conferire identità fiorale ai primordi emergenti: l’ espressione ectopica e costitutiva determina la trasformazione precoce di foglie e gemme ascellari in FIORI Non è un gene MADS-box ; fattore di trascrizione non omologo a nessuna classe nota

LEAFY è il principale interruttore tra i geni di identità meristematica: interrompe la crescita vegetativa e accelera la transizione alla fase riproduttiva La sua espressione precede quella degli altri geni È espresso ai lati del meristema dell’infiorescenza, dove si svilupperanno i meristemi fiorali prima di ogni diversificazione morfologica LFY si lega a elementi cis nel promotore di AP1 e AGAMOUS (CCANTGG) AP1 e AGAMOUS sono geni omeotici: responsabili della formazione degli organi del fiore

LEAFY Regolato da GAs Regolato da CONSTANS Regolato da FT è all’incrocio dei diversi pathways di induzione I livelli di espressione di LEAFY correlano con la forza di diversi segnali che inducono la fioritura Regolato da GAs Elemento di risposta a GA nel promotore Si lega AtMYB33 i cui livelli aumentano nell’apice durante la transizione fiorale Regolato da CONSTANS Meccanismo non noto forse mediato da SOC1 e/o AGL24 Regolato da FT Ridotti livelli di LFY in mutanti ft

SOC1 translocated to nucleus by interaction with AGL24 directly regulates LEAFY. Lee J, Oh M, Park H, Lee I. National Research Laboratory of Plant Developmental Genetics, Department of Biological Sciences, Seoul National University, Seoul, 151-742, Korea. Thus, we propose that the heterodimerization of SOC1 and AGL24 is a key mechanism in activating LFY expression. Plant J. 2008 May 9 [Epub ahead of print]

APETALA 1 (AP1) LEAFY comincia ad essere espresso a livello del meristema della infiorescenza nei siti in cui emergono i meristemi fiorali (MF) ma prima della loro comparsa Successivamente, quando cominciano a formarsi i MF viene espresso AP1 con un profilo spaziale sovrapponibile a LEAFY Dal doppio mutante lfy ap1, a transizione fiorale bloccata: RIDONDANZA

Pattern di espressione dei geni MI mv mf Pattern di espressione dei geni MI

AP1 agisce a valle di LEAFY Espressione ectopica di AP1 In mutanti lfy: conversione del SAM in meristema fiorale Espressione ectopica di LEAFY in mutanti ap1: mantengono le caratteristiche del mutante ap1 AP1 agisce a valle di LEAFY

LEAFY: regolazione diretta i principali regolatori di AP1 sono: LEAFY: regolazione diretta dimostrato il binding in vitro di LFY a sequenze regolative di AP1 e CAL mediante immunoprecipitazione della cromatina FT: mutanti lfy esprimono AP1, doppi mutanti lfy ft non esprimono AP1

LEAFY e AP1 svolgono un ruolo primario nell’iniziare il programma di Riassumendo… LEAFY e AP1 svolgono un ruolo primario nell’iniziare il programma di sviluppo fiorale Mutazioni loss of function in ciascuno dei due provocano conversione omeotica fiorale/vegetativa Mutazioni in entrambi i geni non consentono l’attuazione del programma fiorale Entrambi codificano fattori di trascrizione fortemente espressi nei primordi fiorali

CAULIFLOWER (CAL) AP1 e CAL hanno sequenze strettamente correlate e un pattern di espressione simile; all’inizio espressione in tutto il meristema, poi solo nel I e II verticillo del fiore AP1 e CAL mostrano RIDONDANZA nella specificazione della identità fiorale del meristema Fenotipo molto più evidente in doppi mutanti ap1 cal : meristema dell’ infiorescenza a crescita indeterminata (strutture simili a cime di cavolfiore)

Il gene CAULIFLOWER del cavolfiore coltivato ha un codone di stop che inattiva il prodotto genico Ciò previene la transizione dell’infiorescenza a meristema fiorale generando la ripetizione di meristemi dell’infiorescenza

FRUITFULL (FUL) FUL: correlato strutturalmente a AP1 e CAL Up-regolato nel MI ma escluso inizialmente dal MF FUL primo gene espresso nel MI dopo la transizione fiorale Mutante ful non mostra alterazioni nel MI Tripli mutanti ap1 cal ful assomigliano ai doppi mutanti ap1 cal ma con tratti vegetativi più marcati RIDONDANZA con AP1 e CAL In mutanti ap1, FUL è espresso anche nel MF : AP1 reprime l’espressione di FUL nel MF

APETALA 2 (AP2) Mutanti ap2 solo difetti omeotici: sepali e petali Ma ap1 ap2 e lfy ap2 fenotipo più severo dei singoli mutanti Anche AP2 contribuisce alla specificazione dei meristemi fiorali

I mutanti tfl formano un fiore terminale TERMINAL FLOWER 1 (TFL 1) Gene di identità del meristema dell’infiorescenza Arabidopsis: a infiorescenza indeterminata Il meristema dell’infiorescenza rimane sempre nella zona apicale I meristemi fiorali si sviluppano lateralmente non si forma un fiore terminale I mutanti tfl formano un fiore terminale Nei mutanti tfl AP1, CAL e LFY sono espressi ectopicamente nel MI

TERMINAL FLOWER 1 (TLF1) Il fenotipo dei mutanti tfl1 indica che ha funzioni opposte a LFY, AP1/CAl Previene la trasformazione in meristema fiorale del meristema dell’infiorescenza Mutanti loss of function tfl1 formano precocemente fiori terminali L’espressione costitutiva di TFL1 (35S::TLF1) ritarda la formazione dei fiori

LFY, AP1, CAL specificano l’identità di MF TFL1 specifica l’identità di MI Pattern di espressione di TFL1 in accordo con la funzione di regolatore negativo di LFY, AP1, CAL Espresso nel centro del meristema ed escluso dai primordi AP1 CAL e LFY sopprimono l’espressione di TFL1 nel meristema fiorale

Pattern di espressione dei geni MI mv mf Pattern di espressione dei geni MI

TFL1 strutturalmente è un omologo di FLOWERING LOCUS T (FT) ma la funzione è opposta FT e TFL1 sono omologhi alle PEBP ( phoshatidyethanolamine binding proteins) che negli eucarioti regolano il signaling in processi di crescita e sviluppo La raf-kinase inhibitor protein è una PEBP

TFL1 59% di identità con FT; la sostituzione di un singolo aa: FT (Y85H); TFL (H88Y) è sufficiente ad invertire le funzioni tra i due geni

Modello interazione TFL1 FT con target

TRANSIZIONE FIORALE Una volta avviata la transizione è irreversibile Ciò è assicurato da interazioni cooperative tra i geni di identità meristematica LFY induce AP1 e CAL CAL e AP1 regolano positivamente LFY LFY, AP1 e CAL regolano negativamente TFL1 (e AGL24) In questo modo AP1 e CAL mantengono elevati i livelli di espressione di LFY una volta indotto Le interazioni antagonistiche tra TFL1 e geni FMI fanno si che TFL1 non sia espresso nel meristema fiorale e LFY, AP1e CAL non siano espressi nel meristema dell’infiorescenza

LEAFY è espresso precocemente nel meristema dell’infiorescenza e dà inizio al programma differenziativo LEAFY promuove l’espressione di AP1/CAL nei primordi fiorali (prodotto genico di LFY si lega al promotore del gene AP1) LEAFY AP1/CAL promuovono reciprocamente la loro espressione COOPERATIVITA’: assicura che tutti i geni necessari per la transizione siano presenti ad elevati livelli nello stesso momento

richiesto per la formazione di petali e stami ATTIVAZIONE DEI GENI OMEOTICI (ABC) dati principalmente per LEAFY richiesto per la formazione di petali e stami INDUCE AP1 INDUCE AP3 (LFY si lega al promotore di AP3) Partecipa all’induzione di AG (WUSCHEL) INDUCE i geni SEP (forse)

AP1 (CAL ) Richiesto per lo sviluppo di sepali e petali e indirettamente per lo sviluppo di stami e carpelli poiché attiva l’espressione di AGAMOUS (AG)

TERMINAZIONE Il meristema fiorale è a crescita determinata Una volta completato il differenziamento del fiore il meristema cessa di accrescersi AGAMOUS è l’interruttore per il segnale di terminazione Il segnale coinvolge la funzione di WUSCHEL

Il meccanismo di terminazione è determinato dall’interazione WUS / AG Nel mutante ag-3 gli stami sono sostituiti da carpelli e i carpelli da una reiterazione della sequenza sepali petali. Indica la presenza di un meristema a crescita Indeterminata al centro del fiore . Nel mutante wus-1 la situazione è opposta. Si ha terminazione prematura della attività del meristema e sviluppo incompleto del fiore

AG antagonizza la funzione di WUSCHEL di mantenimento del meristema fiorale Wuschel è richiesto per il mantenimento di tutti i meristemi È inizialmente espresso nel MF ma i livelli calano quando è attivato AG e scompare quando si formano i primordi dei carpelli

L’espressione ectopica di WUS porta alla formazione di stami e carpelli ectopici in maniera AG dipendente. WUSCHEL attiva l’espressione di AG

LEAFY Perché l’attivazione di AG da parte di WUS avviene solo in FM e non in SAM? È richiesto un fattore aggiuntivo LEAFY gene di identità del meristema fiorale (FM), non presente nel meristema vegetativo (SAM)

All’inizio dello sviluppo fiorale WUSCHEL attiva la trascrizione di Il meccanismo coinvolge il sistema WUSCHEL/CLAVATA All’inizio dello sviluppo fiorale WUSCHEL attiva la trascrizione di AGAMOUS AG successivamente reprime la trascrizione di WUS determinando il differenziamento delle ultime cellule meristematiche

Terminazione fiorale attraverso il feedback WUSCHEL/AGAMOUS nella fase di formazione dei carpelli AG (Y) reprimono WUS e si ha la terminazione del meristema fase iniziale: WUS e LFY (x) attivano l’espressione di AG Nella zona in blu

DIMOSTRATO che WUSCHEL e LEAFY si legano a sequenze enhancer distinte sul secondo introne di AGAMOUS Come fa il meccanismo regolativo ad agire al momento giusto? Cioè quando è stato completato il differenziamento dell’ultimo verticillo? I LIVELLI DI ESPRESSIONE di AG aumentano durante tutto il differenziammento forse necessario un valore di soglia di AG per l’inibizione dell’espressione di WUS , che si raggiunge solo dopo il differenziamento dei carpelli Oppure altro fattore regolativo necessario (Y) che compare negli stadi finali

meristema vegetativo meristema fiorale

Esecuzione di pathways di sviluppo paralleli ed in parte sovrapposti In conclusione………… La formazione del fiore richiede l’esecuzione di diversi programmi di sviluppo: Specificazione della posizione del nuovo fiore Formazione del pattern del primordio (simmetria, polarità) Controllo della divisione cellulare per dimensioni e numero dei fiori Formazione degli organi del fiore Esecuzione di pathways di sviluppo paralleli ed in parte sovrapposti Rete di interazioni molecolari molto complessa

Una Istone acetiltransferasi, AtGCN5, sembra necessaria Evidenza di un meccanismo epigenetico del pathway Wuschel /Agamous Una Istone acetiltransferasi, AtGCN5, sembra necessaria per il corretto sviluppo del meristema fiorale e agisce mediante regolazione del sistema WUS/AG

AtGCN5 controlla il pathway di espressione WUS-AG Una mutazione per inserzione di T-DNA nel “bromodomain” del gene AtGCN5 induce la conversione delle infiorescenze in fiori terminali e trasformazioni omeotiche degli organi fiorali I fenotipi correlano con la UP-regolazione della espressione di WUS e AG nel meristema fiorale con l’estensione dei domini di espressione di questi geni e con l’espressione ectopica di AG nel MF AtGCN5 controlla il pathway di espressione WUS-AG

AtGCN5 è omologo alla ACETILTRANSFERASI di lievito Gcn5 Gcn5 è una Istone Acetiltransferasi (HAT) che contiene il “BROMODOMAIN” (con il quale si associa a lisine acetilate) HATs e deacetilasi sono in grado di determinare rimodellamenti della cromatina che possono attivare o reprimere la trascrizione genica

Le istone acetiltransferasi generalmente sono richieste per l’attivazione dei geni Tuttavia è documentato che GCN5 funziona anche come repressore AtGCN5 funzionerebbe come modulatore negativo della espressione di WUS/AG