Metodi di studio

Il primo microscopio ottico Un microscopio semplice Hooke, 1665 Una riproduzione del primo miroscopio di Leeuwenhoek, un disegno di Leeuwenhoek e una fotografia di uno striscio di sangue presa con il microcopio

Un moderno microscopio Un microscopio ottico da ricerca, con telecamera collegata a personal computer (Zeiss)

Microscopi ottici da esercitazione

Anatomia di un microscopio Fotocamera o telecamera Oculari Revolver con obiettivi Stativo Tavolino traslatore Fonte di illuminazione Condensatore Diaframma di campo Vite macrometrica e micrometrica

Anatomia di un microscopio In basso il diaframma di campo con il sistema ad iride che permette di regolare l’ampiezza del fascio di luce che arriva al condensatore; prima di questo sistema è in genere inserito un banco di filtri che permette di cambiare il colore della luce bianca proveniente dalla fonte luminosa. Quest’ultima è costituita da una lampada alogena (munita di sitemi di allineamento e di reostato per la regolazione dell’intensità) che produce una luce bianca. Segue il condensatore, munito di un ulteriore diaframma ad iride (diaframma di apertura) che permette di mettere a fuoco il fascio di luce sul preparato (mediante una vite laterale) o di variare fase e ampiezza del fascio di luce (contrasto di fase e campo oscuro). Notare il sistema di viti che permette la centratura del condensatore. Il tavolino traslatore, sul quale si pone l’oggetto da osservare, è munito di viti per gli spostamenti longitudinali e trasversali.

Anatomia di un microscopio particolare del revolver con gli obiettivi e del tavolino traslatore. Quest’ultimo è munito di sistemi di ritenuta dell’oggetto da osservare. Il revolver può montare diversi obiettivi. Tipicamente: 1 obiettivo 4x per osservazione a secco in campo chiaro (aria fra il preparato e la lente frontale dell’obiettivo) con campo largo, elevata profondità ma bassa apertura numerica. Fascia rossa. 1 obiettivo 10x per l’osservazione a secco in campo chiaro o scuro (fascia gialla). 1 obiettivo 40x per l’osservazione in campo chiaro o scuro (fascia blu). 1 obiettivo 40x per l’osservazione in contrasto di fase (fascia blu Ph2). 1 obiettivo 100x per l’osservazione in campo chiaro o scuro ad immersione (olio fra il preparato e la lente frontale dell’obiettivo), con elevata apertura numerica (1,6; fascia bianca); un obiettivo ad immersione 100x per l’osservazione in contrasto di fase (fascia bianca, Ph3). Il revolver può essere ruotato portando l’obiettivo desiderato in corrispondenza del preparato. Notare la fessura per lenti o filtri addizionali. La formula per il potere di risoluzione è: D= 0,5*l/(N*sen) dove l è la lunghezza d’onda e a è il semiangolo di apertura e N l’indice di rifrazione; negli obiettivi a secco NA (Nsena) è al massimo 0,65, in quelli ad immersione si arriva a 1,4 perché l’olio di immersione ha un indice di rifrazione vicino a quello del vetro: 1,518 ; il condensatore tipicamente ha NA=0,9

Anatomia di un microscopio Oculari: nei moderni microscopi sono quasi sempre 2, ingrandimento 10x, con possibilità di messa a fuoco differenziale e regolazione della distanza interoculare. Un oculare può essere sostituito con un oculare micrometrico, che riporta una scala graduata (micrometro soggettivo) che viene tarata con ogni sistema di lenti usando un vetrino con una scala oggettiva scolpita (micrometro soggettivo) e che consente la misurazione degli oggetti. I moderni microscopi da ricerca sono muniti quasi sempre di una macchina fotografica (ormai sempre più spesso digitale) o di una telecamera (anche questa ormai sempre più spesso digitale) interfacciate con un personal computer, che permette di acquisire ed analizzare le immagini.

Microscopia Ottica

Microscopia Ottica Prime osservazioni Poco informative OSSERVAZIONI A FRESCO Prime osservazioni Il preparato si deteriora velocemente Poco informative Descrizioni brevi ed inesatte

Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato

Preparati in campo chiaro Il contrasto è scarso anche a ingrandimento 1000x Un batterio Campo chiaro, 1000x Cellule

Microscopia Ottica a Contrasto di fase Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo I raggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati

Microscopia Ottica a Contrasto di fase Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a fresco Le varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio

Un batterio 400x Un lievito (S. cerevisiae) 400x Una muffa (G. candidum) 400x

Osservazione in campo scuro Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico

Osservazione in campo scuro

Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio Coloranti vitali Le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse Coloranti che richiedono fissazione Le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule Fare qualche commento sulle colorazioni semplici e colorazioni differenziali

Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3) Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)

Fissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide) Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli" Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto

Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Disidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

Inclusione del campione in in mezzo appropriato paraffina o resina Tessuti sono "molli" e fragili Diversi passaggi in paraffina calda La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione

Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 mm Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia Sezione non colorata

Colorazione delle sezioni con il metodo più appropriato I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo Colorazione automatizzata

Colorazioni Colorazione Contro colorazione Con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazione Del resto del tessuto con un colore contrastante

Ematossilina/Eosina Ematossilina Eosina Ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) Eosina Ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol)

Perchè questa "slide" è blu … Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila È colorata dall'ematossilina Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

… e questa rossa ? Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila È colorata dall'eosina Sono le proteine del citosol

Altre colorazioni PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) Le aree bianche sono lipidi PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) Per sostanze ricche in zuccheri (muco) Tricromica o Hazan-Mallory Per i tessuti connettivi Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa Adiposo Bianco

Osmio o Sudan black Argento ed oro Giemsa Per grasso/lipidi/mielina Cellule nervose Cellule del sangue Osmio o Sudan black Per grasso/lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oro Per fibre delicate e processi cellulari Giemsa Per le cellule del sangue Simile ad E&E

E le aree "bianche"? I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E Sangue, linfa etc. Si riconoscono come ampi spazi bianchi Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima

Interpretate il campione !!! Dovete pensare in 3 dimensioni Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

“Artefatti” Shrinkage Fratture al piano di taglio Lascia dello spazio aggiuntivo Disidratazione e fissaggio Fratture al piano di taglio Tagli netti e ben visibili Lama deteriorata

Colorante precipitato Macchie di colore a "grano di pepe” Tessuto "pinzato" Strumento per l'excisione deteriorato Durante o dopo il sezionamento Pieghe Durante il montaggio

Microscopia Elettronica

Microscopia Elettronica a Trasmissione Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta Alta risoluzione Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi Gli elettroni passano attraverso il campione

Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO: La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO: 200 nm = 2,000 Angstroms Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitosi

Preparazione di Campioni Biologici per TEM Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3) Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari

Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro) La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)

Montaggio delle sezioni su di una griglia Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

Freeze-fracture Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto Evaporazione e deposizione di metalli pesanti Eliminazione materia organica

Autoradiografia Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica

Ottico Elettronico

Microscopia Elettronica a Scansione SEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-D

Preparazione dei campioni per SEM Acquisizione del campione Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie Fissazione e disidratazione Non si include

Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo Oro, cromo, palladio, carbone Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso) Visualizzato al microscopio Fotografato Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X

Microscopia a Fluorescenza Il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi La luce utilizzata ha lunghezze d’onda specifiche per eccitare i fluorocromi I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde

Microscopia a Fluorescenza

Microscopia Confocale La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza d’onda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora l’immagine La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dell’immagine Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser

Metodi analitici Come si analizzano gli organelli o la struttura fine? Metodiche che permettono l’isolamento dei componenti cellulari intatti Centrifugazione, semplice o differenziale Permette l’isolamento sia delle cellule da un tessuto sia delle singole componenti cellulari

Centrifugazione

Centrifugazione differenziale