Processi di associazione Associazione non cooperativa P = macromolecola con n siti di legame identici e indistinguibili X = legante (ioni, piccole molecole,..) A p= 1 atm, T = costante vi sono n equilibri: P + X ⇄ PX PXi + X ⇄ PXi+1 PX + X ⇄ PX2 PXn-1 + X ⇄ PXn PX2 + X ⇄ PX3

A cui sono associate n costanti di equilibrio: L’equilibrio: P + jX ⇄ PXj

Generalmente le concentrazioni delle singole specie PX, PX2, PX3,… non sono sperimentalmente determinabili, mentre è possibile determinare la concentrazione delle specie polimero legato (Σi[PXi]), polimero non associato [P] e molecole di legante libero [X]. β = numero medio di siti occupati

Esempio: n=4 (Emoglobina, Hb) [siti occupati] = [PX] + 2 [PX2] + 3[PX3] + 4[PX4] = = [HbX] + 2 [HbX2] + 3[HbX3] + 4[Hb4] [conc. totale polimero] = [P] + [PX] + [PX2] + [PX3] + [PX4]= = [Hb] + [HbX] + [HbX2] + [HbX3] + [HbX4]

Modello di Langmuir ciascun sito di legame può legare una sola molecola di legante; 2) i siti sono identici; 3) i siti sono indipendenti, quindi non interagiscono tra loro e hanno tutti la stessa energia di interazione con il legante, indipendentemente da quante molecole di legante si siano già legate sul polimero.

Poiché gli n siti sono tutti identici e indistinguibili e consideriamo gli eventi di binding indipendenti tra di loro, possiamo prendere in considerazione l’equilibrio generico: sito libero + X ⇄ sito occupato

Equazione di Langmuir Moltiplicando e dividendo per [P]tot a destra:

Da cui si ottiene: Eq. di Langmuir

nK

Θ = frazione di siti occupati 0 ≤ Θ ≤1 Θ = probabilità di trovare un sito occupato ( n siti identici e indipendenti) 1-Θ = probabilità di trovare un sito libero

L’equazione di Langmuir può essere derivata da semplici considerazioni cinetiche: Per la velocità della reazione diretta: Per la velocità della reazione inversa:

All’equilibrio: Da cui si ottiene facilmente:

Plot di Scatchard

Alternativamente:

Cooperatività positiva Non cooperativo Cooperatività negativa

Nel caso di due diversi siti di legame non interagenti n1 e n2:

Isoterma di associazione (25°C, pH=7.2) di ioni Mg2+ con t-RNA. n1=6 n2=10 K1=7.14104 M-1 K2=5103 M-1

K1+K2

Equilibri di dialisi P + A ⇄ PA P = macromolecola con un solo sito di binding A = ligando

Inizialmente: [P]0 [A]0 Membrana semipermeabile All’equilibrio: [P] [A] [PA]

All’equilibrio: (A)dx = (A)sx Poiché i potenziali chimici di riferimento sono gli stessi: a(A)dx = a(A)sx (A)dx c(A)dx = (A)sx c(A)sx Assumendo: (A)dx≈ (A)sx E quindi: c(A)dx = c(A)sx

Nel box di sinistra: c(A)tot,sx = c(A)b,sx+ c(A)f,sx c(A)0 = c(A)tot,sx + c(A)f,dx = c(A)b,sx + 2 c(A)f,dx c(A)b,sx = c(A)0 - 2 c(A)f,dx Quindi: [PA] = c(A)b,sx = c(A)0 - 2 c(A)f,dx [A] = c(A)sx = c(A)dx [P] = [P]0 - [PA]

La costante di associazione può essere determinata dalle concentrazioni iniziali di polimero e di ligando e dalla determinazione sperimentale della concentrazione di ligando libero (scomparto di destra).

Energetica dei processi di associazione Perdita dei gradi di libertà traslazionali e rotazionali Per un legante di P.M.=200 (T=25°C):

2. Restrizioni alle rotazioni interne Per ogni grado di libertà interno perduto: 3. Effetti idrofobici Per 1Å2 di superficie sottratta al solvente:

4.Interazioni tra gruppi funzionali (legame idrogeno, dipolo-dipolo, Van der Waals) 5. Interazioni elettrostatiche 6. Rilascio di molecole di solvente dalla sfera di idratazione Generalmente a Tamb: Processi di associazione sono generalmente guidati dall’entropia.

Associazione proteina-proteina