PIANTE TRANSGENICHE

PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA Questa caratteristica è alla base della possibilità di creare piante transgeniche la possibilità di rigenerare un’intera pianta da singole cellule differenziate in vitro è possibile ri-generare un organismo vegetale variando il rapporto di auxina e citochinina (ormoni vegetali che regolano proliferazione e differenziamento) •CALLI :ammassi cellulari sdifferenziati propagabili in vitro all'infinito. •GERMOGLI •RADICI

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO Foglia sterilizzata Auxina/Citochina CALLO Auxina/Citochina GERMOGLI Auxina/Citochina RADICI

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO radici germogli Auxina/Citochina Auxina/Citochina

PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE Agrobacterium tumefaciens Bombardamento

Agrobacterium tumefaciens Batterio del suolo Gram- Fitopatogeno che trasforma geneticamente le piante colpite COLPISCE LE DICOTILEDONI (vite, rose, piante frutto carnoso e seme legnoso)

Agrobacterium tumefaciens Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante Plasmide Ti (induttore del Tumore) Contiene il T-DNA (transfer DNA) T-DNA 12-24Kb

Agrobacterium tumefaciens Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante Queste sostanze ATTIVANO i geni VIR (7/8) del plasmide Ti L’attivazione dei geni VIR è necessaria per l’integrazione nel DNA della pianta T-DNA è trasferito come molecola lineare a singolo filamento con meccanismo simile a coniugazione batterica Le regioni ripetute alle estremità (25bp) IMPORTANTI per meccanismo di taglio e integrazione PRIMA: si attivano i geni VIR importanti per trasferimento T-DNA DOPO: si attivano i geni del T-DNA AUXINA-CITOCHINA-OPINA Fonte di Carbonio utilizzabile solo da A.t.

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE Svantaggi: Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta Produzione dell’Opina non è utile per la pianta (dannosa?) Plasmidi Ti sono grandi (200-800Kb) Plasmidi Ti non hanno ORI

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE 2 METODI 1) VETTORE BINARIO Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina Per amplificare il plasmide in E.Coli geni VIR Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO No geni VIR

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE 2) VETTORE COINTEGRATO RICOMBINAZIONE

1) VETTORE BINARIO 2) VETTORE COINTEGRATO

E.coli A. tumefaciens

TRASFORMAZIONE DEL TABACCO

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI Alcuni protocolli elaborati hanno permesso l’utilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso

Bombardamento Utilizzato per la maggior parte delle Monocotiledoni Trasformazione mediata da microproiettili rivestiti da DNA Utilizzato per saggi RAPIDI BASSA frequenza di integrazione stabile ed ereditabile del DNA nel genoma della pianta Possibilità di inserzioni MULTIPLE Utilizzato per inserire DNA in: Monocotiledoni Sospensioni di cellule vegetali Colture di callo Embrioni immaturi Polline di molte piante Mitocondri e cloroplasti

Il DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti Bombardamento Particelle d’oro o tungsteno,ricoperte da DNA (precipitato con CaCl2/spermidina) sono accelerate a 300-600 m/s con un “cannone da particelle” (polvere da sparo, elio, aria compressa) A questa velocità il DNA supera la parete vegetale e penetra nel NUCLEO Il DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti

anche in cloroplasto/mitocondrio Agrobacterium e Bombardamento Infetta solo DICOTILEDONI Infetta MONOCOTILEDONI DICOTILEDONI EMBRIONI etc Introduzione del DNA solo nel NUCLEO Introduzione del DNA anche in cloroplasto/mitocondrio

ALTRI METODI

Preparazione PROTOPLASTO

ORGANISMO MODELLO: Arabidopsis Thaliana

L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO: Le piccole dimensioni Il breve ciclo vitale Il piccolo genoma (più piccolo tra tutte le piante 125 Mb)

L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO: Facilità nel divenire transgenica Notevole disponibilità di mutanti Elevata produzione di semi (1 pianta: 10.000 semi) d:0,5mm

GFP: Green Fluorescent protein Utilizzo di GENI REPORTER nelle cellule vegetali trasformate Importante poter rilevare se la trasformazione è avvenuta GFP: Green Fluorescent protein LUCIFERASI GUS: -D-glucuronidasi

GUS: -D-glucuronidasi GENE reporter uidA codifica per GUS da E.coli GENE reporter uidA codifica per GUS Numerosi glucorinidi possono essere usati come substrato della reazione enzimatica: Colorazione istochimica: X-Gluc Saggi spettrofotometrici: il p-nitrofenil β-D-glucuronide Saggi fluorimetrici: il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide

Studio dei PROMOTORI/ENHANCER (promoter trap/enhancer trap) PROMOTOREassente/PROMOTOREminimo Gene REPORTER Per amplificare il plasmide in E.Coli Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina/G418

ENHANCER TRAP (GUS)

ENHANCER TRAP (GFP)

GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

COLLEZIONE di Arabidopsis GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

Trasferimento di DNA nei CLOROPLASTI Organello necessario per la produzione di Energia. Contiene proprio DNA con genoma circa 105 volte più piccolo del genoma vegetale La maggior parte delle piante superiori contiene nelle cellule fogliari circa 100 cloroplasti. Ogni cloroplasto contine circa 100 copie del DNA del cloroplasto Trasformazione deve avvenire SOLO nel CLOROPLASTO e in TUTTI i CLOROPLASTI UTILIZZO di segnali di trascrizione di tipo PROCARIOTICO

Trasferimento di DNA nei CLOROPLASTI bombardamento Trasformazione con SINGOLO vettore spectinomicina puo’ conferire problemi alle seq omologhe al DNA Resistenza alla spectinomicina Trasformazione con vettore DOPPIO Resistenza alla kanamicina

Produzione di piante transgeniche SENZA MARCATORI Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina Per amplificare il plasmide in E.Coli I GENI MARCATORI (resistenza NEOMICINA/SPECTINOMICINA) POTREBBERO ESSERE TOSSICI e/o ALLERGENICI quando ingeriti Geni per la resistenza agli antibiotici potrebbero passare a batteri della flora intestinale

STRATEGIE per la produzione di piante transgeniche SENZA MARCATORI Utilizzo del GENE MARCATORE e sua successiva rimozione Utilizzo di due costrutti (GENE ESTRANEO + GENE RESISTENZA) Successiva segregazione dei due costrutti 3) Abolizione dell’uso del GENE MARCATORE: screening per PCR