VIRUS A DNA 1) DNA lineare .a DNAds = Adenovirus e Herpesvirus. Poxvirus .b DNAss = Parvovirus 2) DNAds circolare = Hepadnavirus, Poliomavirus e Papillomavirus Replicazione nucleare Replicazione citoplasmatica POXVIRUS Replicazione nucleare e citoplasmatica HEPADNAVIRUS

REPLICAZIONE del DNA VIRALE Target per agenti antivirali SEMICONSERVATIVA Parvovirus - Papillomavirus e Poliomavirus: DNA pol cellulare Adenovirus - Herpesvirus: DNA pol virale > velocità > errori Target per agenti antivirali (es. acyclovir, AZT)

REPLICAZIONE DEI VIRUS a DNA PROBLEMI Richiesta di un primer di inizio della replicazione del DNA lo stesso problema della cellula ospite: le DNA polimerasi non sono in grado di replicare il DNA a partire da uno stampo a ssDNA. Possono solo iniziare la replicazione a partire da regioni ds (5’  3’) come replicare le estremità senza perdere informazione? soluzione: specifiche caratteristiche strutturali dei genomi

Le sequenze Ori siti di legame per proteine (Ori recognition proteins): Palindromi sequenze dentro o vicino a regioni di controllo trascrizionale siti di legame per fattori trascrizionali e proteine con funzione di enhancer , virali e/o cellulari (aumento dell’efficienza di replicazione) sequenze ricche di AT: facilitano lo srotolamentote From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

Replicazione del genoma dei virus a DNA : le proteine di riconoscimento della regione ORI Tutti i virus a DNA devono codificare almeno una proteina per iniziare la replicazione del genoma I virus più grandi codificano anche la loro DNA polimerasi e altre proteine essenziali per la replicazione del genoma Caratteristiche comuni: legame di specifiche proteine alla regione ORI del genoma virale. il legame con le proteine tende a distorcere la regione ORI Molte delle proteine reclutate sulla regione ORI hanno attività di elicasi ATP-dipendente per lo srotolamento del DNA virale eventuale reclutamento di proteine cellulari per la replicazione del DNA virale From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

lettura in ORF differenti TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA Presenza di proteine regolatrici virali e/o cellulari che interagiscono con sequenze “promoter”al 5’ dei geni virali Utilizzano RNA pol II cellulare Trascrizione di geni su filamenti diversi di DNA ed in direzione opposta (es. SV40 = early e late su filamenti opposti) 5’ sequenze “cap” 3’ poli A (100-200 residui di adenina) mRNA con introni Splicing mRNA policistronici lettura in ORF differenti

TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA nel nucleo della cellula ospite ecc: Poxvirus: Utilizzano enzimi presenti nel core del virione Trascritti senza introni. Assenza di splicing - Organizzazione temporale (in 2 tempi) con: Proteine non-strutturali mRNA precoci Replicazione del DNA mRNA tardivi Proteine strutturali

TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA - Organizzazione temporale (in 3 tempi) con: immediati precoci (CHX insensibili) Precoci ritardati (CHX sensibili) mRNA precoci Replicazione del DNA mRNA tardivi Proteine strutturali Es. HERPESVIRUS

legato a istoni cellulari (H2A, H2B, H3 e H4) SV40 POLYOMAVIRIDAE (45 nm) Capside icosaedrico nudo VP1, VP2 e VP3 DNA ds circolare (5.2 kbp) legato a istoni cellulari (H2A, H2B, H3 e H4) mRNA E e L trascritti in modo divergente a partire da ORI Espressione temporale geni precoci replicazione DNA geni tardivi

precoci: proteine T e t ( regolatorie e multifunzionali) Proteine di SV40 precoci: proteine T e t ( regolatorie e multifunzionali) - regolano la loro stessa sintesi transizione della trascrizione da precoce a tardiva - attivano l’espressione dei geni tardivi - essenziale per la replicazione del DNA virale interazione con pRB e p53 (induzione della fase S nella cellula ospite ed inibizione dell’apoptosi cellulare tardive: proteine strutturali (VP1, VP2, VP3)

Replicazione del Genoma di SV40 sito di origine della replicazione (ORI) la replicazione del DNA è bidirezionale (replicazione a Theta) Replicazione del Genoma di SV40 2 esameri di proteina T legano un sito (sito II) della ORI ORI = sequenza unica proteina T (elicasi) insieme a RpA cellulare (proteina di legame ssDNA) srotolano il DNA in modo da permettere la sintesi bidirezionale del DNA Terminazione della sintesi del DNA a 180o da ORI ( congiunzione delle forche di replicazione)

PAPILLOMAVIRIDAE >100 tipi di HPV (Human Papilloma Virus) (55 nm) Capside icosaedrico nudo (L1,L2) DNA ds circolare (8 kbp) legato a istoni cellulari >100 tipi di HPV (Human Papilloma Virus) alto rischio: HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45 Specie-specifici Tropismo per cellule dell’epitelio squamoso Infezione produttiva solo in cellule epiteliali differenziate

2 geni L ( L1 e L2 strutturali) PAPILLOMAVIRUS 7 geni E 2 geni L ( L1 e L2 strutturali) E6 si lega a p53 : segnale per ubiquitina e degradazione E7 attiva la proteina Rb

I PAPILLOMAVIRUS: il ciclo virale

Proteine Virali E7: oncogene virale, interagisce con pRb E2: fattore regolatore della trascrizione e della replicazione del DNA virale. E1: fattore importante per la replicazione del DNA virale, si lega all’origine di replicazione posto nel LCR E4: e’ espressa come gene late. Overlaps E2, ma ha un differente ORF. Viene sintetizzata contemporaneamente alla relicazione del DNA, prima della sintesi di L1 ed L2 E5: è altamente idrofobica, associata a membrane cellulari. Sembra induca una down regulation del sistema MHC E6: oncogene virale, interagisce con p53 E7: oncogene virale, interagisce con pRb

ADENOVIRIDAE Capside icosaedrico nudo 60-90 nm isolati da adenoidi umane - 1953 Capside icosaedrico nudo 60-90 nm Circa 100 sierotipi umani Infezioni respiratorie ed enteriche Congiuntiviti acute infezioni latenti nel tessuto linfatico di tonsille, adenoidi e placche del Peyer (alcuni tipi oncogeni per roditori neonati)

ITR = Inverted Terminal Repeat ADENOVIRUS Genoma: dsDNA lineare (30-35 Kbp) Terminal protein P55 5’ desossicitosina ITR ITR = Inverted Terminal Repeat ITR

ADENOVIRUS Espressione del genoma Geni precoci = E1a, E1b, E2a, E2b (DNA pol), E3, E4 Geni tardivi = L1, L2, L3, L4, L5 (proteine strutturali)

Adenovirus: replicazione del DNA lineare la PROTEINA TERMINALE funge da PRIMER 1. la Polimerasi virale forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP il legame di Nf-1 e Oct-1 alla sequenza core Ori facilita la formazione del complesso 2. il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi (in continuo) del filamento di DNA complementare Ad ssDBP (E2), e Topoisomerasi 3. l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats” 4.associazione Pol-pre-TP e …… 5. sintesi (in continuo) del filamento complementare From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

HERPESVIRIDAE Capside icosaedrico con involucro Sottofamiglia Genere Tipo Herpes simplex virus tipo 1 Simplexvirus Alphaherpesvirinae Herpes simplex virus tipo 2 Varicellovirus Virus Varicella Zoster 150 nm Cytomegalovirus Citomegalovirus Betaherpesvirinae Herpesvirus Roseolovirus umano 6 Capside icosaedrico con involucro Herpesvirus umano 7 Gammaherpesvirinae Lymphocrypto- virus Epstein Barr virus Herpesvirus umano 8 Rhadinovirus o del sarcoma di Kaposi

Genoma di HSV-1 DNAds lineare (150 Kb) Sequenze Uniche = U (L e S) Sequenze Ripetute = R (L e S), (T e I)

Genoma del virus Herpes Simplex di Tipo 1 Il genoma lineare quando entra del nucleo della cellula ospite circolarizza per la presenza di sequenze presenti alle due estremità TR Il genoma viene trascritto ad opera della RNA polimerasi II cellulare

HSV-1:REPLICAZIONE DEL GENOMA proteine b necessarie per la sintesi del DNA virale ORI binding protein (UL9) helicase/primase complex (UL5, UL8, UL52). DNA polymerase (UL30), DNA binding proteins (UL42, UL29, ICP8)

Modello di replicazione del DNA dei virus erpetici Cerchio rotante 1. taglio della molecola circolare : 3’-OH utilizzato come primer 2. la sintesi della nuova elica provoca la dislocazione dell’elica complementare 3 e 4. sintesi in continuo della forma circolare e sintesi discontinua sull’elica dislocata con formazione di concatameri di dsDNA Il taglio del DNA (sequenza terminale ripetuta a) congiuntamente al processo di incapsidamento del DNA genera i nuovi genomi virali lineari From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

cascata di espressione genica assemblaggio e maturazione CICLO DI REPLICAZIONE cascata di espressione genica assemblaggio e maturazione

1 molecola lineare DNAss PARVOVIRIDAE Capside icosaedrico non-rivestito 18-28 nm : 1 molecola lineare DNAss 4.5 - 6 Kb Parvovirus autonomi Dependovirus o Virus adeno-associati (AAV)

Adeno-associati AAV Ad Virus satelliti: Per replicare richiedono attiva replicazione cellulare o la co-infezione con un virus helper (adenovirus o herpesvirus)

Sequenze terminali palindromiche PARVOVIRUS: DNA lineare ss (4.5 - 6 Kb) 115nt 115nt Sequenze terminali Sequenze terminali palindromiche filamento codificante: filamento(-)

PARVOVIRUS Regioni separate per: proteine non strutturali (gene NS1, gene rep) proteine strutturali (geni cap)

REPLICAZIONE DEL GENOMA DEI PARVOVIRUS rolling hairpin model REP78 reazione nicking necessaria per la risoluzione dei terminali. attività di elicasi essenziale per srotolamento della regione ITR +