DROSOPHILA TRANSGENICA “ENHANCER TRAP” 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI

TECNICA dell’ENHANCER TRAP Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer. Tecnica utilizzata per: Identificazione di nuovi geni Analisi dell’espressione di geni tempo/tessuto specifici 3) Permette analisi molti geni simultaneamente

TECNICA dell’ENHANCER TRAP A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4 A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.

A) Enhancer TRAP P(LacZ)

LINEE “ENHANCER TRAP” a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di oltre 4000 ceppi b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di espressione

B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito. GAL4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence) Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni LIEVITO DROSOPHILA

2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di NUOVI GENI GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO GAL4/UAS  SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica Collezione di ceppi di Drosophila Promotore UBIQUITARIO Promotore SPECIFICO (spazio) Promotore Temp-SENS (tempo) IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica PROMOTORE Tessuto specifico ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO GAL4/UAS  SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI SPAZIO TEMPO

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI WT MUTATO DELETO antisenso WT UAS/Cbl oncogene

Studio del PROMOTORE Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE: identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ Il geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione L’attività della betagalattosidasi permette di identificare la regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

Studio del PROMOTORE Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino. Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

embrione cervello intestino ghiandole salivari

RNA interference Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans ANDREW FIRE*, SIQUN XU*, MARY K. MONTGOMERY*, STEVEN A. KOSTAS*†, SAMUEL E. DRIVER‡ & CRAIG C. MELLO‡ Fire at al, Nature V391 pp 806-811 (1998)

dsRNAi is cut in 21-23 nt fragments Zamore et al, Cell, v101 pp25-33 (2000)

Ambion Inc. Austin, Texas, USA